Polymerase-Kettenreaktion

Ein Streifen mit acht PCR-Gefäßen, die jeweils eine 100-μl-Reaktionsmischung enthalten ⓘ

Ein Streifen mit acht PCR-Gefäßen wird in einen Thermocycler eingesetzt ⓘ

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine weit verbreitete Methode zur schnellen Herstellung von Millionen bis Milliarden von Kopien (vollständig oder teilweise) einer bestimmten DNA-Probe, die es Wissenschaftlern ermöglicht, eine sehr kleine DNA-Probe zu nehmen und sie (oder einen Teil davon) auf eine Menge zu vervielfältigen, die für eine detaillierte Untersuchung ausreicht. Die PCR wurde 1983 von dem amerikanischen Biochemiker Kary Mullis bei der Cetus Corporation erfunden; Mullis und der Biochemiker Michael Smith, der andere wichtige Methoden zur Manipulation der DNA entwickelt hatte, wurden 1993 gemeinsam mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. ⓘ

Die PCR ist von grundlegender Bedeutung für viele Verfahren, die bei genetischen Tests und in der Forschung eingesetzt werden, einschließlich der Analyse alter DNA-Proben und der Identifizierung von Infektionserregern. Bei der PCR werden Kopien sehr kleiner Mengen von DNA-Sequenzen in einer Reihe von Zyklen mit Temperaturänderungen exponentiell vervielfältigt. Die PCR ist heute eine gängige und oft unverzichtbare Technik, die in der medizinischen Laborforschung für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt wird, darunter in der biomedizinischen Forschung und in der Kriminaltechnik. ⓘ

Die meisten PCR-Methoden basieren auf thermischen Zyklen. Dabei werden die Reagenzien wiederholten Zyklen von Erwärmung und Abkühlung ausgesetzt, um verschiedene temperaturabhängige Reaktionen zu ermöglichen, insbesondere das Schmelzen der DNA und die enzymgesteuerte DNA-Replikation. Bei der PCR werden zwei Hauptreagenzien verwendet - Primer (kurze einzelsträngige DNA-Fragmente, die als Oligonukleotide bezeichnet werden und eine komplementäre Sequenz zur Ziel-DNA-Region darstellen) und eine DNA-Polymerase. Im ersten Schritt der PCR werden die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix bei hoher Temperatur in einem Prozess, der als Nukleinsäuredenaturierung bezeichnet wird, physikalisch getrennt. Im zweiten Schritt wird die Temperatur gesenkt und die Primer binden an die komplementären DNA-Sequenzen. Die beiden DNA-Stränge werden dann zu Vorlagen für die DNA-Polymerase, die enzymatisch einen neuen DNA-Strang aus freien Nukleotiden, den Bausteinen der DNA, zusammensetzt. Im weiteren Verlauf der PCR wird die erzeugte DNA selbst als Vorlage für die Replikation verwendet, wodurch eine Kettenreaktion in Gang gesetzt wird, bei der die ursprüngliche DNA-Vorlage exponentiell vervielfältigt wird. ⓘ

Bei fast allen PCR-Anwendungen wird eine hitzestabile DNA-Polymerase verwendet, z. B. die Taq-Polymerase, ein Enzym, das ursprünglich aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus isoliert wurde. Wäre die verwendete Polymerase hitzeempfindlich, würde sie bei den hohen Temperaturen des Denaturierungsschritts denaturieren. Vor der Verwendung der Taq-Polymerase musste die DNA-Polymerase bei jedem Zyklus manuell zugegeben werden, was ein langwieriger und kostspieliger Prozess war. ⓘ

Zu den Anwendungen dieser Technik gehören das Klonen von DNA für die Sequenzierung, das Klonen und die Manipulation von Genen, die Genmutagenese, die Erstellung von DNA-basierten Phylogenien oder die Funktionsanalyse von Genen, die Diagnose und Überwachung genetischer Störungen, die Amplifikation alter DNA, die Analyse genetischer Fingerabdrücke für die Erstellung von DNA-Profilen (z. B. in der Forensik und bei Abstammungstests) und der Nachweis von Krankheitserregern in Nukleinsäuretests für die Diagnose von Infektionskrankheiten. ⓘ

Funktionsweise des PCR-Tests (Video) ⓘ

Grundsätze

Ein Thermocycler für die PCR ⓘ

Ein älterer Drei-Temperatur-Thermocycler für die PCR ⓘ

Bei der PCR wird ein bestimmter Bereich eines DNA-Strangs (das DNA-Ziel) amplifiziert. Die meisten PCR-Methoden vervielfältigen DNA-Fragmente mit einer Länge zwischen 0,1 und 10 Kilobasenpaaren (kbp), obwohl einige Techniken die Vervielfältigung von Fragmenten bis zu 40 kbp ermöglichen. Die Menge des amplifizierten Produkts wird durch die verfügbaren Substrate in der Reaktion bestimmt, die mit fortschreitender Reaktion begrenzt wird. ⓘ

Für einen grundlegenden PCR-Aufbau sind mehrere Komponenten und Reagenzien erforderlich, darunter:

eine DNA-Vorlage, die die zu amplifizierende DNA-Zielregion enthält
eine DNA-Polymerase, ein Enzym, das neue DNA-Stränge polymerisiert; besonders häufig wird die hitzebeständige Taq-Polymerase verwendet, da sie während des DNA-Denaturierungsprozesses bei hohen Temperaturen eher intakt bleibt
zwei DNA-Primer, die komplementär zu den 3'-Enden (drei Primer) jedes der Sinn- und Anti-Sinn-Stränge des DNA-Ziels sind (DNA-Polymerase kann nur an eine doppelsträngige DNA-Region binden und sich von dieser aus verlängern; ohne Primer gibt es keine doppelsträngige Initiationsstelle, an die die Polymerase binden kann); spezifische Primer, die komplementär zur DNA-Zielregion sind, werden zuvor ausgewählt und häufig in einem Labor speziell angefertigt oder von kommerziellen biochemischen Anbietern gekauft
Desoxynukleosidtriphosphate oder dNTPs (manchmal auch "Desoxynukleotidtriphosphate" genannt; Nukleotide mit Triphosphatgruppen), die Bausteine, aus denen die DNA-Polymerase einen neuen DNA-Strang synthetisiert
eine Pufferlösung, die ein geeignetes chemisches Umfeld für eine optimale Aktivität und Stabilität der DNA-Polymerase bietet
zweiwertige Kationen, typischerweise Magnesium- (Mg) oder Mangan- (Mn) Ionen; Mg²⁺ ist am gebräuchlichsten, aber Mn²⁺ kann für die PCR-vermittelte DNA-Mutagenese verwendet werden, da eine höhere Mn²⁺-Konzentration die Fehlerquote bei der DNA-Synthese erhöht; und einwertige Kationen, typischerweise Kalium- (K) Ionen ⓘ

Die Reaktion wird in der Regel in einem Volumen von 10-200 μL in kleinen Reaktionsgefäßen (0,2-0,5 mL Volumen) in einem Thermocycler durchgeführt. Der Thermocycler erwärmt und kühlt die Reaktionsgefäße, um die für die einzelnen Reaktionsschritte erforderlichen Temperaturen zu erreichen (siehe unten). Viele moderne Thermocycler nutzen den Peltier-Effekt, der das Aufheizen und Abkühlen des Blocks mit den PCR-Gefäßen einfach durch Umkehrung des elektrischen Stroms ermöglicht. Dünnwandige Reaktionsgefäße haben eine günstige Wärmeleitfähigkeit, die ein schnelles thermisches Gleichgewicht ermöglicht. Die meisten Thermocycler sind mit beheizten Deckeln ausgestattet, um Kondensation am oberen Ende des Reaktionsgefäßes zu verhindern. Ältere Thermocycler ohne beheizten Deckel benötigen eine Ölschicht auf dem Reaktionsgemisch oder eine Wachskugel im Inneren des Röhrchens. ⓘ

Verfahren

In der Regel besteht die PCR aus einer Reihe von 20-40 wiederholten Temperaturwechseln, den so genannten Thermocyclern, wobei jeder Zyklus in der Regel aus zwei oder drei einzelnen Temperaturschritten besteht (siehe Abbildung unten). Dem Zyklus geht häufig ein einzelner Temperaturschritt bei einer sehr hohen Temperatur (>90 °C) voraus, gefolgt von einem Halt am Ende zur Verlängerung des Endprodukts oder einer kurzen Lagerung. Die verwendeten Temperaturen und die Dauer der einzelnen Zyklen hängen von einer Vielzahl von Parametern ab, darunter das für die DNA-Synthese verwendete Enzym, die Konzentration der zweiwertigen Ionen und dNTPs in der Reaktion sowie die Schmelztemperatur (T_m) der Primer. Die einzelnen Schritte, die den meisten PCR-Methoden gemeinsam sind, lauten wie folgt:

Initialisierung: Dieser Schritt ist nur bei DNA-Polymerasen erforderlich, die eine Wärmeaktivierung durch Hot-Start-PCR erfordern. Er besteht aus dem Erhitzen der Reaktionskammer auf eine Temperatur von 94-96 °C (201-205 °F) bzw. 98 °C (208 °F), wenn extrem thermostabile Polymerasen verwendet werden, die dann für 1-10 Minuten gehalten wird.
Denaturierung: Dieser Schritt ist der erste reguläre Zyklus und besteht aus dem Erhitzen der Reaktionskammer auf 94-98 °C (201-208 °F) für 20-30 Sekunden. Dies führt zum Schmelzen oder zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Matrize, indem die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen gebrochen werden, wodurch zwei einzelsträngige DNA-Moleküle entstehen.
Ausglühen: Im nächsten Schritt wird die Reaktionstemperatur für 20-40 Sekunden auf 50-65 °C gesenkt, damit die Primer an die einzelsträngigen DNA-Moleküle anlagern können. In der Regel werden zwei verschiedene Primer in die Reaktionsmischung gegeben: einer für jedes der beiden einzelsträngigen Komplemente, die die Zielregion enthalten. Die Primer sind selbst einzelsträngige Sequenzen, die jedoch viel kürzer sind als die Länge der Zielregion und nur sehr kurze Sequenzen am 3'-Ende jedes Strangs ergänzen. ⓘ

Es ist von entscheidender Bedeutung, eine geeignete Temperatur für den Annealing-Schritt zu bestimmen, da Effizienz und Spezifität stark von der Annealing-Temperatur beeinflusst werden. Diese Temperatur muss niedrig genug sein, um die Hybridisierung des Primers mit dem Strang zu ermöglichen, aber hoch genug, damit die Hybridisierung spezifisch ist, d. h. der Primer sollte nur an einen perfekt komplementären Teil des Strangs binden und nirgendwo anders. Ist die Temperatur zu niedrig, kann der Primer nur unvollständig binden. Ist sie zu hoch, bindet der Primer möglicherweise überhaupt nicht. Eine typische Annealing-Temperatur liegt etwa 3-5 °C unter der Tm der verwendeten Primer. Stabile Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen werden nur dann gebildet, wenn die Primersequenz sehr eng mit der Template-Sequenz übereinstimmt. In diesem Schritt bindet die Polymerase an das Primer-Template-Hybrid und beginnt mit der DNA-Bildung.

Verlängerung/Dehnung: Die Temperatur in diesem Schritt hängt von der verwendeten DNA-Polymerase ab; die optimale Aktivitätstemperatur für die thermostabile DNA-Polymerase der Taq-Polymerase liegt bei etwa 75-80 °C (167-176 °F), obwohl bei diesem Enzym üblicherweise eine Temperatur von 72 °C (162 °F) verwendet wird. In diesem Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase einen neuen DNA-Strang, der zum DNA-Matrizenstrang komplementär ist, indem sie freie dNTPs aus dem Reaktionsgemisch hinzufügt, die in 5'-zu-3'-Richtung komplementär zur Matrize sind, und die 5'-Phosphatgruppe der dNTPs mit der 3'-Hydroxygruppe am Ende des naszierenden (verlängerten) DNA-Strangs kondensiert. Die genaue Zeit, die für die Elongation benötigt wird, hängt sowohl von der verwendeten DNA-Polymerase als auch von der Länge der zu amplifizierenden DNA-Zielregion ab. Als Faustregel gilt, dass die meisten DNA-Polymerasen bei ihrer optimalen Temperatur eintausend Basen pro Minute polymerisieren. Unter optimalen Bedingungen (d. h. wenn es keine Beschränkungen durch limitierende Substrate oder Reagenzien gibt) wird bei jedem Verlängerungs-/Verlängerungsschritt die Anzahl der DNA-Zielsequenzen verdoppelt. Mit jedem aufeinanderfolgenden Zyklus werden die ursprünglichen Template-Stränge plus alle neu erzeugten Stränge zu Template-Strängen für die nächste Verlängerungsrunde, was zu einer exponentiellen (geometrischen) Amplifikation der spezifischen DNA-Zielregion führt. ⓘ

Die Prozesse der Denaturierung, des Annealings und der Elongation bilden einen einzigen Zyklus. Es sind mehrere Zyklen erforderlich, um die DNA-Zielregion auf Millionen von Kopien zu amplifizieren. Die Formel zur Berechnung der Anzahl der nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen gebildeten DNA-Kopien lautet 2n, wobei n die Anzahl der Zyklen ist. Eine auf 30 Zyklen eingestellte Reaktion ergibt also 2³⁰ oder 1.073.741.824 Kopien der ursprünglichen doppelsträngigen DNA-Zielregion.

Abschließende Elongation: Dieser einzelne Schritt ist fakultativ, wird jedoch bei einer Temperatur von 70-74 °C (158-165 °F) (dem Temperaturbereich, der für die optimale Aktivität der meisten in der PCR verwendeten Polymerasen erforderlich ist) für 5-15 Minuten nach dem letzten PCR-Zyklus durchgeführt, um sicherzustellen, dass die verbleibende einzelsträngige DNA vollständig elongiert ist.
Abschließendes Halten: Der letzte Schritt kühlt die Reaktionskammer für unbestimmte Zeit auf 4-15 °C ab und kann für die kurzfristige Lagerung der PCR-Produkte verwendet werden. ⓘ

Mit Ethidiumbromid gefärbte PCR-Produkte nach der Gelelektrophorese. Zwei Primer-Sets wurden verwendet, um eine Zielsequenz aus drei verschiedenen Gewebeproben zu amplifizieren. In Probe Nr. 1 findet keine Amplifikation statt; die DNA-Banden in Probe Nr. 2 und Nr. 3 zeigen die erfolgreiche Amplifikation der Zielsequenz an. Das Gel zeigt auch eine Positivkontrolle und eine DNA-Leiter mit DNA-Fragmenten definierter Länge zur Größenbestimmung der Banden in den experimentellen PCRs. ⓘ

Um zu überprüfen, ob die PCR erfolgreich die erwartete DNA-Zielregion (manchmal auch als Amplimer oder Amplikon bezeichnet) erzeugt hat, kann eine Agarosegel-Elektrophorese zur Größentrennung der PCR-Produkte eingesetzt werden. Die Größe der PCR-Produkte wird durch Vergleich mit einer DNA-Leiter bestimmt, einem Molekulargewichtsmarker, der DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und neben den PCR-Produkten auf dem Gel läuft. ⓘ

Stadien

Exponentielle Amplifikation ⓘ

Wie bei anderen chemischen Reaktionen werden die Reaktionsgeschwindigkeit und die Effizienz der PCR durch limitierende Faktoren beeinflusst. Daher kann der gesamte PCR-Prozess je nach Reaktionsfortschritt in drei Stufen unterteilt werden:

Exponentielle Amplifikation: Bei jedem Zyklus verdoppelt sich die Produktmenge (unter der Annahme einer 100%igen Reaktionseffizienz). Nach 30 Zyklen kann eine einzelne DNA-Kopie auf bis zu 1.000.000.000 (eine Milliarde) Kopien vermehrt werden. In gewissem Sinne wird also die Replikation eines einzelnen DNA-Strangs in einem Röhrchen unter kontrollierten Bedingungen manipuliert. Die Reaktion ist sehr empfindlich: Es müssen nur winzige Mengen an DNA vorhanden sein.
Abflachungsphase: Die Reaktion verlangsamt sich, da die DNA-Polymerase an Aktivität verliert und der Verbrauch von Reagenzien wie dNTPs und Primern dazu führt, dass diese immer begrenzter werden.
Plateau: Aufgrund der Erschöpfung der Reagenzien und des Enzyms wird kein Produkt mehr gebildet. ⓘ

Optimierung

In der Praxis kann die PCR aus verschiedenen Gründen fehlschlagen, z. B. aufgrund von Empfindlichkeit oder Kontamination. Eine Kontamination mit Fremd-DNA kann zu falschen Produkten führen und wird mit Laborprotokollen und -verfahren angegangen, die Mischungen vor der PCR von potenziellen DNA-Kontaminanten trennen. Wenn beispielsweise DNA von einem Tatort analysiert wird, könnte ein einzelnes DNA-Molekül vom Laborpersonal amplifiziert werden und die Untersuchung verfälschen. Daher werden die PCR-Setup-Bereiche von der Analyse oder Reinigung anderer PCR-Produkte getrennt, es werden Einweg-Plastikgeräte verwendet, und die Arbeitsfläche zwischen den Reaktions-Setups muss gründlich gereinigt werden. ⓘ

Die Spezifität kann durch die Versuchsbedingungen so eingestellt werden, dass keine unerwünschten Produkte erzeugt werden. Primer-Design-Techniken sind wichtig, um die PCR-Produktausbeute zu verbessern und die Bildung unspezifischer Produkte zu vermeiden. Die Verwendung alternativer Pufferkomponenten oder Polymeraseenzyme kann bei der Amplifikation langer oder anderweitig problematischer DNA-Regionen helfen. Beispielsweise soll die Q5-Polymerase ~280 Mal weniger fehleranfällig sein als die Taq-Polymerase. Sowohl die Durchführungsparameter (z. B. Temperatur und Dauer der Zyklen) als auch die Zugabe von Reagenzien wie Formamid können die Spezifität und Ausbeute der PCR erhöhen. Computersimulationen der theoretischen PCR-Ergebnisse (elektronische PCR) können zur Unterstützung des Primerdesigns durchgeführt werden. ⓘ

Anwendungen

Selektive DNA-Isolierung

Die PCR ermöglicht die Isolierung von DNA-Fragmenten aus genomischer DNA durch selektive Amplifikation eines bestimmten DNA-Bereichs. Dieser Einsatz der PCR ergänzt viele Verfahren, wie z. B. die Erzeugung von Hybridisierungssonden für die Southern- oder Northern-Hybridisierung und die DNA-Klonierung, für die größere Mengen an DNA benötigt werden, die eine bestimmte DNA-Region repräsentieren. Die PCR versorgt diese Techniken mit großen Mengen reiner DNA und ermöglicht die Analyse von DNA-Proben auch aus sehr kleinen Mengen von Ausgangsmaterial. ⓘ

Weitere Anwendungen der PCR sind die DNA-Sequenzierung zur Bestimmung unbekannter PCR-amplifizierter Sequenzen, wobei einer der Amplifikationsprimer für die Sanger-Sequenzierung verwendet werden kann, sowie die Isolierung einer DNA-Sequenz zur Beschleunigung rekombinanter DNA-Technologien, bei denen eine DNA-Sequenz in ein Plasmid, einen Phagen oder ein Cosmid (je nach Größe) oder das genetische Material eines anderen Organismus eingefügt wird. Bakterienkolonien (z. B. E. coli) können mittels PCR schnell auf korrekte DNA-Vektorkonstrukte untersucht werden. Die PCR kann auch für den genetischen Fingerabdruck verwendet werden, eine forensische Technik zur Identifizierung einer Person oder eines Organismus durch den Vergleich experimenteller DNA mit verschiedenen PCR-Methoden. ⓘ

Elektrophorese von PCR-amplifizierten DNA-Fragmenten:

Vater
Kind
Mutter

Das Kind hat einige, aber nicht alle Fingerabdrücke seiner Eltern geerbt, wodurch es einen neuen, einzigartigen Fingerabdruck erhält. ⓘ

Einige PCR-Fingerprint-Methoden haben eine hohe Trennschärfe und können verwendet werden, um genetische Beziehungen zwischen Individuen, z. B. zwischen Eltern und Kindern oder zwischen Geschwistern, festzustellen, und werden bei Vaterschaftstests eingesetzt (Abb. 4). Diese Technik kann auch zur Bestimmung evolutionärer Beziehungen zwischen Organismen eingesetzt werden, wenn bestimmte molekulare Uhren verwendet werden (z. B. die 16S rRNA- und recA-Gene von Mikroorganismen). ⓘ

Amplifikation und Quantifizierung von DNA

Da die PCR die DNA-Regionen vervielfältigt, auf die sie abzielt, können mit der PCR extrem kleine Probenmengen analysiert werden. Dies ist oft entscheidend für forensische Analysen, wenn nur eine geringe DNA-Menge als Beweismittel zur Verfügung steht. Die PCR kann auch bei der Analyse alter DNA eingesetzt werden, die mehrere zehntausend Jahre alt ist. Diese auf PCR basierenden Techniken wurden erfolgreich bei Tieren, wie z. B. einem vierzigtausend Jahre alten Mammut, und auch bei menschlicher DNA eingesetzt, und zwar in Anwendungen, die von der Analyse ägyptischer Mumien bis zur Identifizierung eines russischen Zaren und des Körpers des englischen Königs Richard III. reichen. ⓘ

Quantitative PCR- oder Real Time PCR-Methoden (qPCR, nicht zu verwechseln mit RT-PCR) ermöglichen die Schätzung der Menge einer bestimmten Sequenz in einer Probe - eine Technik, die häufig zur quantitativen Bestimmung der Genexpression eingesetzt wird. Die quantitative PCR ist ein bewährtes Instrument zur DNA-Quantifizierung, mit dem die Anhäufung von DNA-Produkten nach jeder Runde der PCR-Amplifikation gemessen wird. ⓘ

Die qPCR ermöglicht die Quantifizierung und den Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz in Echtzeit, da sie die Konzentration während des Syntheseprozesses misst. Es gibt zwei Methoden für den gleichzeitigen Nachweis und die Quantifizierung. Die erste Methode besteht in der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die unspezifisch zwischen den Doppelsträngen zurückgehalten werden. Bei der zweiten Methode werden Sonden verwendet, die für bestimmte Sequenzen kodieren und fluoreszierend markiert sind. Der Nachweis von DNA mit diesen Methoden ist erst nach der Hybridisierung der Sonden mit ihrer komplementären DNA (cDNA) möglich. Eine interessante Technikkombination ist die Echtzeit-PCR und die reverse Transkription. Diese hochentwickelte Technik, RT-qPCR genannt, ermöglicht die Quantifizierung einer kleinen RNA-Menge. Durch diese kombinierte Technik wird die mRNA in cDNA umgewandelt, die dann mittels qPCR quantifiziert wird. Diese Technik senkt die Fehlerwahrscheinlichkeit am Endpunkt der PCR und erhöht die Chancen für den Nachweis von Genen, die mit genetischen Krankheiten wie Krebs in Verbindung stehen. Die Labors verwenden die RT-qPCR, um die Genregulation empfindlich zu messen. Die mathematischen Grundlagen für die zuverlässige Quantifizierung der PCR und der RT-qPCR erleichtern die Durchführung genauer Anpassungsverfahren von experimentellen Daten in der Forschung, in der Medizin, in der Diagnostik und bei Infektionskrankheiten. ⓘ

Medizinische und diagnostische Anwendungen

Potenzielle Eltern können darauf getestet werden, ob sie Genträger sind, oder ihre Kinder können darauf getestet werden, ob sie tatsächlich von einer Krankheit betroffen sind. DNA-Proben für pränatale Tests können durch Fruchtwasseruntersuchung, Chorionzottenbiopsie oder sogar durch die Analyse seltener fötaler Zellen, die im Blutkreislauf der Mutter zirkulieren, gewonnen werden. Die PCR-Analyse ist auch für die genetische Präimplantationsdiagnostik unerlässlich, bei der einzelne Zellen eines sich entwickelnden Embryos auf Mutationen untersucht werden.

Die PCR kann auch als Teil eines empfindlichen Tests zur Gewebetypisierung eingesetzt werden, der für Organtransplantationen unerlässlich ist. Seit 2008 gibt es sogar einen Vorschlag, die traditionellen Antikörper-basierten Tests zur Bestimmung der Blutgruppe durch PCR-basierte Tests zu ersetzen.
Bei vielen Krebsarten treten Veränderungen an Onkogenen auf. Durch die Verwendung von PCR-basierten Tests zur Untersuchung dieser Mutationen können Therapieschemata manchmal individuell auf den Patienten zugeschnitten werden. Die PCR ermöglicht die Frühdiagnose bösartiger Erkrankungen wie Leukämie und Lymphome, die derzeit in der Krebsforschung am weitesten entwickelt ist und bereits routinemäßig eingesetzt wird. PCR-Assays können direkt an genomischen DNA-Proben durchgeführt werden, um translokationsspezifische bösartige Zellen mit einer Empfindlichkeit nachzuweisen, die mindestens 10.000-mal höher ist als bei anderen Methoden. Die PCR ist im medizinischen Bereich sehr nützlich, da sie die Isolierung und Amplifikation von Tumorsuppressoren ermöglicht. Die quantitative PCR kann beispielsweise zur Quantifizierung und Analyse einzelner Zellen sowie zur Erkennung von DNA-, mRNA- und Proteinbestätigungen und -kombinationen eingesetzt werden. ⓘ

Anwendungen bei Infektionskrankheiten

Die PCR ermöglicht eine schnelle und hochspezifische Diagnose von Infektionskrankheiten, einschließlich solcher, die durch Bakterien oder Viren verursacht werden. Die PCR ermöglicht auch die Identifizierung von nicht kultivierbaren oder langsam wachsenden Mikroorganismen wie Mykobakterien, anaeroben Bakterien oder Viren aus Gewebekulturen und Tiermodellen. Die Grundlage für diagnostische PCR-Anwendungen in der Mikrobiologie ist der Nachweis von Infektionserregern und die Unterscheidung zwischen nicht-pathogenen und pathogenen Stämmen anhand spezifischer Gene. ⓘ

Die Charakterisierung und der Nachweis von Infektionserregern wurden durch die PCR auf folgende Weise revolutioniert:

Das humane Immundefizienzvirus (HIV) ist ein schwer zu findendes und auszurottendes Ziel. Die ersten Tests zum Nachweis einer Infektion beruhten auf dem Vorhandensein von Antikörpern gegen das Virus, die im Blutkreislauf zirkulieren. Antikörper treten jedoch erst viele Wochen nach der Infektion auf, mütterliche Antikörper maskieren die Infektion eines Neugeborenen, und therapeutische Mittel zur Bekämpfung der Infektion haben keinen Einfluss auf die Antikörper. Es wurden PCR-Tests entwickelt, die nur ein einziges virales Genom in der DNA von über 50 000 Wirtszellen nachweisen können. Infektionen können früher erkannt werden, Blutspenden können direkt auf das Virus untersucht werden, Neugeborene können sofort auf Infektionen getestet werden, und die Wirkung antiviraler Behandlungen kann quantifiziert werden.
Einige Krankheitsorganismen, wie z. B. der Erreger der Tuberkulose, lassen sich nur schwer von Patienten abnehmen und nur langsam im Labor züchten. Mit PCR-Tests ist es möglich, eine geringe Anzahl von (lebenden oder toten) Krankheitserregern in geeigneten Proben nachzuweisen. Detaillierte genetische Analysen können auch zum Nachweis von Antibiotikaresistenzen eingesetzt werden, was eine sofortige und wirksame Therapie ermöglicht. Auch die Auswirkungen der Therapie können sofort bewertet werden.
Die Ausbreitung eines Krankheitsorganismus in Populationen von Haus- oder Wildtieren kann durch PCR-Tests überwacht werden. In vielen Fällen kann das Auftreten neuer virulenter Subtypen nachgewiesen und überwacht werden. Die Subtypen eines Organismus, die für frühere Epidemien verantwortlich waren, können ebenfalls durch PCR-Analysen bestimmt werden.
Virale DNA kann durch PCR nachgewiesen werden. Die verwendeten Primer müssen spezifisch für die Zielsequenzen in der DNA eines Virus sein, und die PCR kann für diagnostische Analysen oder die DNA-Sequenzierung des viralen Genoms verwendet werden. Die hohe Empfindlichkeit der PCR ermöglicht den Virusnachweis kurz nach der Infektion und sogar vor dem Ausbruch der Krankheit. Eine solche frühzeitige Erkennung kann den Ärzten einen erheblichen Zeitvorsprung bei der Behandlung verschaffen. Die Virusmenge ("Viruslast") in einem Patienten kann auch durch PCR-basierte DNA-Quantifizierungstechniken (siehe unten) quantifiziert werden. Eine Variante der PCR (RT-PCR) wird für den Nachweis viraler RNA anstelle von DNA verwendet: Bei diesem Test wird das Enzym Reverse Transkriptase verwendet, um eine DNA-Sequenz zu erzeugen, die mit der viralen RNA übereinstimmt; diese DNA wird dann wie bei der üblichen PCR-Methode amplifiziert. Die RT-PCR wird häufig zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virusgenoms eingesetzt.
Krankheiten wie Pertussis (Keuchhusten) werden durch das Bakterium Bordetella pertussis verursacht. Dieses Bakterium ist durch eine schwere akute Atemwegsinfektion gekennzeichnet, die verschiedene Tiere und Menschen befällt und zum Tod vieler Kleinkinder geführt hat. Das Pertussis-Toxin ist ein Proteinexotoxin, das sich über zwei Dimere an Zellrezeptoren bindet und mit verschiedenen Zelltypen wie T-Lymphozyten reagiert, die eine Rolle bei der Zellimmunität spielen. Die PCR ist ein wichtiges Testinstrument, mit dem Sequenzen innerhalb des Gens für das Pertussis-Toxin nachgewiesen werden können. Da die PCR eine hohe Empfindlichkeit für das Toxin und eine schnelle Durchlaufzeit aufweist, ist sie im Vergleich zur Kultur sehr effizient für die Diagnose von Pertussis. ⓘ

Forensische Anwendungen

Die Entwicklung von PCR-basierten Protokollen für den genetischen (oder DNA-) Fingerabdruck hat in der Forensik breite Anwendung gefunden:

DNA-Proben werden häufig an Tatorten entnommen und mittels PCR analysiert.
In seiner aussagekräftigsten Form kann der genetische Fingerabdruck jede einzelne Person eindeutig von der gesamten Weltbevölkerung unterscheiden. Winzige DNA-Proben können von einem Tatort isoliert und mit der DNA von Verdächtigen oder einer DNA-Datenbank mit früheren Beweisen oder Verurteilten verglichen werden. Einfachere Versionen dieser Tests werden häufig verwendet, um Verdächtige während einer strafrechtlichen Untersuchung schnell auszuschließen. Beweise aus jahrzehntealten Verbrechen können getestet werden, um die ursprünglich verurteilten Personen zu bestätigen oder zu entlasten.
Die forensische DNA-Typisierung ist ein wirksames Mittel zur Identifizierung oder Entlastung von Verdächtigen aufgrund der Analyse von Beweisen, die an einem Tatort gefunden wurden. Das menschliche Genom hat viele sich wiederholende Bereiche, die in Gensequenzen oder in nicht codierenden Bereichen des Genoms zu finden sind. Bis zu 40 % der menschlichen DNA ist repetitiv. Es gibt zwei verschiedene Kategorien dieser sich wiederholenden, nicht codierenden Regionen im Genom. Die erste Kategorie heißt Variable Number Tandem Repeats (VNTR), die 10-100 Basenpaare lang sind, und die zweite Kategorie heißt Short Tandem Repeats (STR) und besteht aus sich wiederholenden Abschnitten mit 2-10 Basenpaaren. Mit der PCR werden mehrere bekannte VNTRs und STRs mit Primern amplifiziert, die jede der repetitiven Regionen flankieren. Die Größe der Fragmente, die von einer Person für jede der STRs erhalten werden, zeigt an, welche Allele vorhanden sind. Durch die Analyse mehrerer STRs für eine Person wird ein Satz von Allelen für jede Person gefunden, der statistisch gesehen wahrscheinlich einzigartig ist. Die Forscher haben die vollständige Sequenz des menschlichen Genoms ermittelt. Diese Sequenz ist über die NCBI-Website leicht zugänglich und wird in vielen realen Anwendungen verwendet. Das FBI hat beispielsweise eine Reihe von DNA-Markerstellen zusammengestellt, die zur Identifizierung verwendet werden und als DNA-Datenbank Combined DNA Index System (CODIS) bezeichnet werden. Die Verwendung dieser Datenbank ermöglicht eine statistische Analyse zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, dass eine DNA-Probe übereinstimmen wird. Die PCR ist ein sehr leistungsfähiges und aussagekräftiges Analyseinstrument für die forensische DNA-Typisierung, da die Forscher nur eine sehr kleine Menge der zu analysierenden Ziel-DNA benötigen. Ein einzelnes menschliches Haar mit angehängtem Haarfollikel reicht beispielsweise aus, um die Analyse durchzuführen. Ebenso können einige wenige Spermien, Hautproben unter den Fingernägeln oder eine kleine Menge Blut genug DNA für eine schlüssige Analyse liefern.
Weniger differenzierte Formen des DNA-Fingerabdrucks können bei DNA-Vaterschaftstests helfen, bei denen eine Person mit ihren nahen Verwandten abgeglichen wird. Die DNA von nicht identifizierten menschlichen Überresten kann getestet und mit der von möglichen Eltern, Geschwistern oder Kindern verglichen werden. Ähnliche Tests können verwendet werden, um die biologischen Eltern eines adoptierten (oder entführten) Kindes zu ermitteln. Auch der tatsächliche biologische Vater eines Neugeborenen kann bestätigt (oder ausgeschlossen) werden.
Es hat sich gezeigt, dass die PCR AMGX/AMGY-Konstruktion nicht nur die Amplifikation von DNA-Sequenzen aus einer sehr kleinen Menge Genom erleichtert. Es kann auch für die Geschlechtsbestimmung in Echtzeit aus forensischen Knochenproben verwendet werden. Dies bietet eine leistungsstarke und effektive Möglichkeit zur Bestimmung des Geschlechts in forensischen Fällen und bei alten Proben. ⓘ

Anwendungen in der Forschung

Die PCR wurde in vielen Forschungsbereichen der Molekulargenetik eingesetzt:

Die PCR ermöglicht die schnelle Herstellung kurzer DNA-Stücke, selbst wenn nur die Sequenz der beiden Primer bekannt ist. Diese Fähigkeit der PCR ergänzt viele Methoden, wie z. B. die Herstellung von Hybridisierungssonden für die Southern- oder Northern-Blot-Hybridisierung. Die PCR liefert diesen Techniken große Mengen reiner DNA, manchmal als Einzelstrang, und ermöglicht so die Analyse auch von sehr kleinen Mengen an Ausgangsmaterial.
Auch bei der DNA-Sequenzierung kann die PCR hilfreich sein. Bekannte DNA-Abschnitte können leicht von einem Patienten mit einer genetischen Krankheitsmutation hergestellt werden. Durch Modifikationen der Amplifikationstechnik können Segmente aus einem völlig unbekannten Genom extrahiert werden, oder es kann nur ein einzelner Strang eines interessierenden Bereichs erzeugt werden.
Die PCR bietet zahlreiche Anwendungen für das herkömmliche Verfahren des DNA-Klonens. Sie kann aus einem größeren Genom, das möglicherweise nur in geringen Mengen vorhanden ist, Segmente für die Einfügung in einen Vektor extrahieren. Mit einem einzigen Satz von "Vektorprimern" können auch Fragmente analysiert oder extrahiert werden, die bereits in Vektoren eingefügt wurden. Einige Änderungen des PCR-Protokolls können Mutationen (allgemein oder ortsabhängig) eines eingefügten Fragments hervorrufen.
Sequence-tagged sites" ist ein Verfahren, bei dem die PCR als Indikator dafür verwendet wird, dass ein bestimmtes Genomsegment in einem bestimmten Klon vorhanden ist. Im Rahmen des Humangenomprojekts war diese Anwendung unerlässlich, um die sequenzierten Kosmidklone zu kartieren und die Ergebnisse der verschiedenen Labors zu koordinieren.
Eine Anwendung der PCR ist die phylogenetische Analyse von DNA aus alten Quellen, wie z. B. aus den geborgenen Knochen von Neandertalern, aus gefrorenem Gewebe von Mammuts oder aus dem Gehirn ägyptischer Mumien. In einigen Fällen kann die stark degradierte DNA aus diesen Quellen in den frühen Stadien der Amplifikation neu zusammengesetzt werden.
Eine häufige Anwendung der PCR ist die Untersuchung von Mustern der Genexpression. Gewebe (oder sogar einzelne Zellen) können in verschiedenen Stadien analysiert werden, um festzustellen, welche Gene aktiv geworden sind bzw. welche abgeschaltet wurden. Bei dieser Anwendung kann auch die quantitative PCR eingesetzt werden, um das tatsächliche Ausmaß der Expression zu quantifizieren.
Die Fähigkeit der PCR, mehrere Loci aus einzelnen Spermien gleichzeitig zu amplifizieren, hat die eher traditionelle Aufgabe der genetischen Kartierung durch die Untersuchung chromosomaler Kreuzungen nach der Meiose erheblich verbessert. Seltene Crossover-Ereignisse zwischen sehr nahe beieinander liegenden Loci konnten durch die Analyse von Tausenden von einzelnen Spermien direkt beobachtet werden. Ebenso können ungewöhnliche Deletionen, Insertionen, Translokationen oder Inversionen analysiert werden, ohne die langwierigen und mühsamen Prozesse der Befruchtung, Embryogenese usw. abwarten (oder bezahlen) zu müssen.
Ortsgerichtete Mutagenese: Mit Hilfe der PCR können mutierte Gene mit Mutationen erzeugt werden, die von den Wissenschaftlern nach Belieben ausgewählt werden. Diese Mutationen können gewählt werden, um zu verstehen, wie Proteine ihre Funktionen erfüllen, und um die Proteinfunktion zu verändern oder zu verbessern. ⓘ

Vorteile

Die PCR hat eine Reihe von Vorteilen. Sie ist relativ einfach zu verstehen und anzuwenden und liefert schnell Ergebnisse. Die Technik ist sehr empfindlich und kann Millionen bis Milliarden von Kopien eines bestimmten Produkts für die Sequenzierung, das Klonen und die Analyse erzeugen. Die qRT-PCR hat die gleichen Vorteile wie die PCR, mit dem zusätzlichen Vorteil der Quantifizierung des synthetisierten Produkts. Daher kann sie zur Analyse von Veränderungen der Genexpression in Tumoren, Mikroben oder anderen Krankheiten eingesetzt werden. ⓘ

Die PCR ist ein sehr leistungsfähiges und praktisches Forschungsinstrument. Die Sequenzierung unbekannter Ätiologien vieler Krankheiten wird durch die PCR herausgefunden. Die Technik kann dazu beitragen, die Sequenz von bisher unbekannten Viren zu identifizieren, die mit den bereits bekannten verwandt sind, und uns so ein besseres Verständnis der Krankheit selbst vermitteln. Wenn es gelingt, das Verfahren weiter zu vereinfachen und empfindliche nichtradiometrische Nachweissysteme zu entwickeln, wird die PCR in den kommenden Jahren einen wichtigen Platz im klinischen Labor einnehmen. ⓘ

Beschränkungen

Eine wesentliche Einschränkung der PCR besteht darin, dass vorherige Informationen über die Zielsequenz erforderlich sind, um die Primer zu erzeugen, die eine selektive Amplifikation ermöglichen. Das bedeutet, dass der PCR-Anwender in der Regel die genaue(n) Sequenz(en) stromaufwärts der Zielregion auf jeder der beiden einzelsträngigen Vorlagen kennen muss, um sicherzustellen, dass die DNA-Polymerase ordnungsgemäß an die Primer-Template-Hybride bindet und anschließend während der DNA-Synthese die gesamte Zielregion erzeugt. ⓘ

Wie alle Enzyme sind auch die DNA-Polymerasen fehleranfällig, was wiederum Mutationen in den erzeugten PCR-Fragmenten zur Folge hat. ⓘ

Eine weitere Einschränkung der PCR besteht darin, dass selbst kleinste Mengen kontaminierter DNA vervielfältigt werden können, was zu irreführenden oder zweideutigen Ergebnissen führt. Um das Kontaminationsrisiko zu minimieren, sollten die Forscher getrennte Räume für die Reagenzienvorbereitung, die PCR und die Analyse des Produkts reservieren. Die Reagenzien sollten in Einweg-Aliquots dosiert werden. Es sollten routinemäßig Pipetten mit Einwegkolben und extralangen Pipettenspitzen verwendet werden. Darüber hinaus sollte sichergestellt werden, dass der Laboraufbau einem unidirektionalen Arbeitsablauf folgt. Materialien und Reagenzien, die in den PCR- und Analyseräumen verwendet werden, sollten niemals ohne gründliche Dekontamination in den PCR-Vorbereitungsraum gebracht werden. ⓘ

Umweltproben, die Huminsäuren enthalten, können die PCR-Amplifikation hemmen und zu ungenauen Ergebnissen führen. ⓘ

Variationen

Allel-spezifische PCR: eine Diagnose- oder Klonierungstechnik, die auf Einzel-Nukleotid-Variationen (SNVs, nicht zu verwechseln mit SNPs) beruht (Unterschiede zwischen einzelnen Basen bei einem Patienten). Sie erfordert eine vorherige Kenntnis der DNA-Sequenz, einschließlich der Unterschiede zwischen den Allelen, und verwendet Primer, deren 3'-Enden die SNV einschließen (in der Regel wird ein Basenpaar-Puffer um die SNV eingebaut). Die PCR-Amplifikation ist unter strengen Bedingungen wesentlich weniger effizient, wenn eine Fehlpaarung zwischen Matrize und Primer vorliegt, so dass eine erfolgreiche Amplifikation mit einem SNP-spezifischen Primer das Vorhandensein des spezifischen SNP in einer Sequenz signalisiert. Weitere Informationen finden Sie unter SNP-Genotypisierung.
Assembly-PCR oder Polymerase Cycling Assembly (PCA): künstliche Synthese langer DNA-Sequenzen durch PCR an einem Pool langer Oligonukleotide mit kurzen überlappenden Segmenten. Die Oligonukleotide wechseln zwischen Sinn- und Antisinn-Richtung, und die überlappenden Segmente bestimmen die Reihenfolge der PCR-Fragmente, wodurch das endgültige lange DNA-Produkt selektiv erzeugt wird.
Asymmetrische PCR: amplifiziert bevorzugt einen DNA-Strang in einer doppelsträngigen DNA-Matrize. Sie wird bei der Sequenzierung und Hybridisierungssondierung eingesetzt, wenn nur einer der beiden komplementären Stränge amplifiziert werden muss. Die PCR wird wie üblich durchgeführt, jedoch mit einem großen Überschuss des Primers für den zu amplifizierenden Strang. Wegen der langsamen (arithmetischen) Amplifikation im weiteren Verlauf der Reaktion, nachdem der limitierende Primer verbraucht ist, sind zusätzliche PCR-Zyklen erforderlich. Eine neuere Abwandlung dieses Verfahrens, die so genannte Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), verwendet einen limitierenden Primer mit einer höheren Schmelztemperatur (Tm) als der überschüssige Primer, um die Reaktionseffizienz aufrechtzuerhalten, wenn die Konzentration des limitierenden Primers in der Mitte der Reaktion abnimmt.
Konvektive PCR: eine pseudo-isotherme Methode zur Durchführung der PCR. Anstatt die PCR-Mischung wiederholt zu erhitzen und abzukühlen, wird die Lösung einem thermischen Gradienten unterworfen. Die daraus resultierende, durch thermische Instabilität hervorgerufene konvektive Strömung sorgt dafür, dass die PCR-Reagenzien aus den heißen und kalten Bereichen automatisch umgeschichtet werden, so dass die PCR wiederholt durchgeführt werden kann. Parameter wie die thermischen Randbedingungen und die Geometrie des PCR-Gehäuses können optimiert werden, um eine robuste und schnelle PCR zu erzielen, indem die Entstehung chaotischer Strömungsfelder genutzt wird. Ein solcher Aufbau der konvektiven Strömungs-PCR reduziert den Energiebedarf des Geräts und die Betriebszeit erheblich.
Dial-out-PCR: eine hochparallele Methode zur Gewinnung präziser DNA-Moleküle für die Gensynthese. Eine komplexe Bibliothek von DNA-Molekülen wird vor der massiven parallelen Sequenzierung mit eindeutigen flankierenden Tags modifiziert. Mit Hilfe von Tag-directed Primern können dann Moleküle mit den gewünschten Sequenzen durch PCR gewonnen werden.
Digitale PCR (dPCR): Sie dient zur Messung der Menge einer Ziel-DNA-Sequenz in einer DNA-Probe. Die DNA-Probe wird stark verdünnt, so dass nach der Durchführung vieler paralleler PCRs einige von ihnen kein einziges Molekül der Ziel-DNA erhalten. Die Konzentration der Ziel-DNA wird anhand des Anteils der negativen Ergebnisse berechnet. Daher auch der Name "digitale PCR".
Helicase-abhängige Amplifikation: ähnelt der traditionellen PCR, verwendet jedoch eine konstante Temperatur, anstatt Denaturierungs- und Annealing-/Extensionszyklen zu durchlaufen. Anstelle der thermischen Denaturierung wird die DNA-Helikase verwendet, ein Enzym, das die DNA abwickelt.
Hot Start PCR: Eine Technik, die die unspezifische Amplifikation während der ersten Phasen der PCR reduziert. Sie kann manuell durchgeführt werden, indem die Reaktionskomponenten auf die Denaturierungstemperatur (z. B. 95 °C) erhitzt werden, bevor die Polymerase hinzugefügt wird. Es wurden spezielle Enzymsysteme entwickelt, die die Aktivität der Polymerase bei Raumtemperatur hemmen, entweder durch die Bindung eines Antikörpers oder durch das Vorhandensein von kovalent gebundenen Inhibitoren, die erst nach einem Aktivierungsschritt bei hoher Temperatur dissoziieren. Die Hot-Start/Cold-Finish-PCR wird mit neuen Hybridpolymerasen erreicht, die bei Raumtemperatur inaktiv sind und bei der Elongationstemperatur sofort aktiviert werden.
Die In-silico-PCR (digitale PCR, virtuelle PCR, elektronische PCR, e-PCR) bezieht sich auf computergestützte Werkzeuge zur Berechnung theoretischer Ergebnisse der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines bestimmten Satzes von Primern (Sonden) zur Amplifikation von DNA-Sequenzen aus einem sequenzierten Genom oder Transkriptom. Die In-silico-PCR wurde als Lehrmittel für die Molekularbiologie vorgeschlagen.
Intersequenz-spezifische PCR (ISSR): eine PCR-Methode für das DNA-Fingerprinting, bei der Regionen zwischen einfachen Sequenzwiederholungen amplifiziert werden, um einen eindeutigen Fingerabdruck der amplifizierten Fragmentlängen zu erzeugen.
Inverse PCR: wird üblicherweise zur Identifizierung der flankierenden Sequenzen um genomische Insertionen herum verwendet. Sie umfasst eine Reihe von DNA-Verdauungen und Selbstligierungen, die zu bekannten Sequenzen an beiden Enden der unbekannten Sequenz führen.
Ligationsvermittelte PCR: verwendet kleine DNA-Linker, die an die interessierende DNA ligiert werden, und mehrere Primer, die an die DNA-Linker anlagern; sie wurde für die DNA-Sequenzierung, das Genome Walking und das DNA-Footprinting verwendet.
Methylierungsspezifische PCR (MSP): wurde von Stephen Baylin und James G. Herman an der Johns Hopkins School of Medicine entwickelt und wird zum Nachweis der Methylierung von CpG-Inseln in genomischer DNA verwendet. Die DNA wird zunächst mit Natriumbisulfit behandelt, wodurch unmethylierte Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, das von PCR-Primern als Thymin erkannt wird. Anschließend werden zwei PCRs mit der modifizierten DNA durchgeführt, wobei Primer-Sets verwendet werden, die bis auf die CpG-Inseln innerhalb der Primer-Sequenzen identisch sind. An diesen Stellen erkennt ein Primer-Set DNA mit Cytosinen, um methylierte DNA zu amplifizieren, und ein Set erkennt DNA mit Uracil oder Thymin, um unmethylierte DNA zu amplifizieren. MSP mit qPCR kann auch durchgeführt werden, um eher quantitative als qualitative Informationen über Methylierung zu erhalten.
Miniprimer-PCR: verwendet eine thermostabile Polymerase (S-Tbr), die von kurzen Primern ("smalligos") mit nur 9 oder 10 Nukleotiden ausgehen kann. Diese Methode ermöglicht eine gezielte PCR auf kleinere Primer-Bindungsregionen und wird zur Amplifikation konservierter DNA-Sequenzen, wie z. B. des 16S- (oder eukaryotischen 18S-) rRNA-Gens, verwendet.
Multiplexe ligationsabhängige Sondenamplifikation (MLPA): ermöglicht die Amplifikation mehrerer Ziele mit einem einzigen Primerpaar und vermeidet so die Auflösungsbeschränkungen der Multiplex-PCR (siehe unten).
Multiplex-PCR: besteht aus mehreren Primer-Sets in einer einzigen PCR-Mischung, um Amplikons unterschiedlicher Größe zu erzeugen, die für verschiedene DNA-Sequenzen spezifisch sind. Durch die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Gene können mit einem einzigen Testdurchlauf zusätzliche Informationen gewonnen werden, für die sonst ein Vielfaches an Reagenzien und Zeit erforderlich wäre. Die Annealing-Temperaturen für die einzelnen Primer-Sets müssen so optimiert werden, dass sie in einer einzigen Reaktion korrekt funktionieren, ebenso wie die Amplikongrößen. Das heißt, die Länge der Basenpaare sollte so unterschiedlich sein, dass sich bei der Gelelektrophorese unterschiedliche Banden bilden.
Nanopartikel-unterstützte PCR (nanoPCR): Einige Nanopartikel (NPs) können die Effizienz der PCR erhöhen (daher die Bezeichnung nanoPCR), und einige können sogar die ursprünglichen PCR-Verstärker übertreffen. Es wurde berichtet, dass Quantenpunkte (QDs) die Spezifität und Effizienz der PCR verbessern können. Einzelwandige Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs) und mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (MWCNTs) sind effizient bei der Verbesserung der Amplifikation von langen PCR. Kohlenstoffnanopulver (CNP) können die Effizienz der wiederholten PCR und der langen PCR verbessern, während Zinkoxid, Titandioxid und Ag-Nanopartikel die PCR-Ausbeute erhöhen. Frühere Daten deuteten darauf hin, dass nichtmetallische NPs eine akzeptable Amplifikationstreue aufwiesen. In Anbetracht der Tatsache, dass viele NPs die PCR-Effizienz steigern können, liegt es auf der Hand, dass es wahrscheinlich ein großes Potenzial für Verbesserungen der nanoPCR-Technologie und für die Produktentwicklung gibt.
Verschachtelte PCR: Erhöht die Spezifität der DNA-Amplifikation, indem der Hintergrund aufgrund unspezifischer DNA-Amplifikation reduziert wird. Zwei Primersätze werden in zwei aufeinander folgenden PCR-Reaktionen verwendet. In der ersten Reaktion wird ein Primerpaar verwendet, um DNA-Produkte zu erzeugen, die neben dem beabsichtigten Ziel noch aus unspezifisch amplifizierten DNA-Fragmenten bestehen können. Das Produkt bzw. die Produkte werden dann in einer zweiten PCR mit einem Satz von Primern verwendet, deren Bindungsstellen sich ganz oder teilweise von denen der in der ersten Reaktion verwendeten Primer unterscheiden und jeweils 3' davon liegen. Die verschachtelte PCR ist bei der spezifischen Amplifikation langer DNA-Fragmente oft erfolgreicher als die herkömmliche PCR, erfordert aber eine genauere Kenntnis der Zielsequenzen.
Overlap-Extension-PCR oder Spleißen durch Überlappungsextension (SOEing): eine gentechnische Technik, mit der zwei oder mehr DNA-Fragmente, die komplementäre Sequenzen enthalten, zusammengespleißt werden. Sie wird verwendet, um DNA-Stücke zu verbinden, die Gene, regulatorische Sequenzen oder Mutationen enthalten; die Technik ermöglicht die Schaffung von spezifischen und langen DNA-Konstrukten. Sie kann auch Deletionen, Insertionen oder Punktmutationen in eine DNA-Sequenz einführen.
PAN-AC: verwendet isothermische Bedingungen für die Amplifikation und kann in lebenden Zellen eingesetzt werden.
Quantitative PCR (qPCR): wird zur Messung der Menge einer Zielsequenz verwendet (in der Regel in Echtzeit). Sie misst quantitativ die Ausgangsmengen an DNA, cDNA oder RNA. Die quantitative PCR wird in der Regel eingesetzt, um festzustellen, ob eine DNA-Sequenz in einer Probe vorhanden ist und wie viele Kopien davon in der Probe vorhanden sind. Die quantitative PCR hat einen sehr hohen Präzisionsgrad. Quantitative PCR-Methoden verwenden Fluoreszenzfarbstoffe wie Sybr Green, EvaGreen oder fluorophorhaltige DNA-Sonden wie TaqMan, um die Menge des amplifizierten Produkts in Echtzeit zu messen. Manchmal wird sie auch als RT-PCR (Echtzeit-PCR) abgekürzt, aber diese Abkürzung sollte nur für die reverse Transkriptions-PCR verwendet werden. qPCR ist die geeignete Abkürzung für quantitative PCR (Echtzeit-PCR).
Umgekehrte Komplement-PCR (RC-PCR): Ermöglicht die Hinzufügung von funktionellen Domänen oder Sequenzen nach Wahl, die unabhängig voneinander an beide Enden des erzeugten Amplikons in einer einzigen geschlossenen Röhrenreaktion angehängt werden. Diese Methode erzeugt zielspezifische Primer innerhalb der Reaktion durch die Interaktion von universellen Primern (die die gewünschten Sequenzen oder Domänen enthalten, die angehängt werden sollen) und RC-Sonden.
Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR): zur Vervielfältigung von DNA aus RNA. Reverse Transkriptase transkribiert RNA in cDNA, die dann durch PCR amplifiziert wird. Die RT-PCR wird häufig bei der Erstellung von Expressionsprofilen eingesetzt, um die Expression eines Gens zu bestimmen oder die Sequenz eines RNA-Transkripts zu ermitteln, einschließlich der Start- und Terminierungsstellen der Transkription. Wenn die genomische DNA-Sequenz eines Gens bekannt ist, kann die RT-PCR verwendet werden, um die Lage der Exons und Introns im Gen zu bestimmen. Das 5'-Ende eines Gens (entsprechend der Transkriptionsstartstelle) wird in der Regel durch RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) identifiziert.
RNase H-abhängige PCR (rhPCR): eine Modifikation der PCR, bei der Primer mit einem 3'-Verlängerungsblock verwendet werden, der durch ein thermostabiles RNase HII-Enzym entfernt werden kann. Dieses System reduziert Primer-Dimere und ermöglicht Multiplex-Reaktionen mit einer höheren Anzahl von Primern.
Single Specific Primer-PCR (SSP-PCR): ermöglicht die Amplifikation doppelsträngiger DNA, auch wenn die Sequenzinformation nur an einem Ende verfügbar ist. Diese Methode ermöglicht die Amplifikation von Genen, für die nur eine partielle Sequenzinformation verfügbar ist, und erlaubt ein unidirektionales Genom-Walking von bekannten in unbekannte Regionen des Chromosoms.
Festphasen-PCR: umfasst mehrere Bedeutungen, darunter Polony Amplification (bei der PCR-Kolonien z. B. in einer Gelmatrix entstehen), Bridge PCR (Primer werden kovalent an eine feste Trägeroberfläche gebunden), konventionelle Festphasen-PCR (bei der die asymmetrische PCR in Gegenwart eines Primers auf einem festen Träger durchgeführt wird, dessen Sequenz mit der eines wässrigen Primers übereinstimmt) und verstärkte Festphasen-PCR (bei der die konventionelle Festphasen-PCR durch die Verwendung von Primern mit hohem Tm-Wert und verschachtelten Primern auf einem festen Träger verbessert werden kann, wobei optional ein thermischer "Schritt" angewendet werden kann, um das Priming auf dem festen Träger zu fördern).
Suizid-PCR: wird typischerweise in der Paläogenetik oder bei anderen Studien eingesetzt, bei denen die Vermeidung von falsch-positiven Ergebnissen und die Gewährleistung der Spezifität des amplifizierten Fragments höchste Priorität haben. Ursprünglich wurde sie in einer Studie beschrieben, um das Vorhandensein der Mikrobe Yersinia pestis in Zahnproben nachzuweisen, die aus Gräbern von Menschen aus dem 14. Jahrhundert stammten, die vermutlich während der mittelalterlichen Pest-Epidemie gestorben waren. Die Methode schreibt vor, dass jede Primer-Kombination nur einmal in einer PCR verwendet wird (daher der Begriff "Selbstmord"), die niemals in einer positiven Kontroll-PCR-Reaktion verwendet worden sein sollte, und dass die Primer immer auf eine genomische Region abzielen sollten, die niemals zuvor im Labor mit diesem oder einem anderen Satz von Primern amplifiziert wurde. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass im Labor keine kontaminierende DNA aus früheren PCR-Reaktionen vorhanden ist, die andernfalls zu falsch positiven Ergebnissen führen könnte.
Thermische asymmetrische verschachtelte PCR (TAIL-PCR): zur Isolierung einer unbekannten Sequenz, die eine bekannte Sequenz flankiert. Innerhalb der bekannten Sequenz verwendet die TAIL-PCR ein verschachteltes Primerpaar mit unterschiedlichen Annealing-Temperaturen; ein degenerierter Primer wird zur Amplifikation in der anderen Richtung der unbekannten Sequenz verwendet.
Touchdown-PCR (Step-down-PCR): eine Variante der PCR, bei der der unspezifische Hintergrund durch schrittweises Absenken der Annealing-Temperatur im Verlauf des PCR-Zyklus verringert werden soll. Die Annealing-Temperatur liegt bei den ersten Zyklen in der Regel einige Grad (3-5 °C) über der Tm der verwendeten Primer, während sie bei den späteren Zyklen einige Grad (3-5 °C) unter der Tm des Primers liegt. Die höheren Temperaturen sorgen für eine größere Spezifität bei der Primerbindung, und die niedrigeren Temperaturen ermöglichen eine effizientere Amplifikation der spezifischen Produkte, die während der ersten Zyklen gebildet werden.
Universal Fast Walking: für das Genom-Walking und das genetische Fingerprinting unter Verwendung einer spezifischeren "zweiseitigen" PCR als bei herkömmlichen "einseitigen" Ansätzen (unter Verwendung von nur einem gen-spezifischen Primer und einem allgemeinen Primer, was zu artefaktischem "Rauschen" führen kann) aufgrund eines Mechanismus, der die Bildung von Lariatstrukturen beinhaltet. Optimierte Derivate der UFW sind LaNe RAGE (lariat-abhängige nested PCR für die schnelle Amplifikation genomischer DNA-Enden), 5'RACE LaNe und 3'RACE LaNe. ⓘ

Geschichte

Schematische Darstellung eines Primerpaares. Die Verwendung von Primern in einem In-vitro-Assay, um die DNA-Synthese zu ermöglichen, war eine wichtige Innovation, die die Entwicklung der PCR ermöglichte. ⓘ

Die hitzebeständigen Enzyme, die eine Schlüsselkomponente der Polymerase-Kettenreaktion sind, wurden in den 1960er Jahren als Produkt einer mikrobiellen Lebensform entdeckt, die in den überhitzten Gewässern der Pilzquelle im Yellowstone lebte. ⓘ

In einer 1971 im Journal of Molecular Biology veröffentlichten Arbeit von Kjell Kleppe und Mitarbeitern aus dem Labor von H. Gobind Khorana wurde erstmals eine Methode beschrieben, bei der eine kurze DNA-Vorlage mit Primern in vitro mit Hilfe eines enzymatischen Assays repliziert wird. Diese frühe Manifestation des PCR-Grundprinzips fand damals jedoch keine große Beachtung, und die Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion im Jahr 1983 wird im Allgemeinen Kary Mullis zugeschrieben. ⓘ

"Baby Blue", ein Prototyp eines PCR-Geräts aus dem Jahr 1986 ⓘ

Als Mullis 1983 die PCR entwickelte, arbeitete er in Emeryville, Kalifornien, für die Cetus Corporation, eines der ersten Biotechnologieunternehmen, wo er für die Synthese kurzer DNA-Ketten zuständig war. Mullis hat geschrieben, dass er die Idee für die PCR hatte, als er eines Nachts in seinem Auto den Pacific Coast Highway entlangfuhr. Er spielte im Geiste mit einer neuen Methode zur Analyse von Veränderungen (Mutationen) in der DNA, als ihm klar wurde, dass er stattdessen eine Methode zur Vervielfältigung beliebiger DNA-Regionen durch wiederholte Zyklen der Vervielfältigung, angetrieben durch die DNA-Polymerase, erfunden hatte. Im Scientific American fasste Mullis das Verfahren zusammen: "Ausgehend von einem einzigen Molekül des genetischen Materials DNA kann die PCR an einem Nachmittag 100 Milliarden ähnliche Moleküle erzeugen. Die Reaktion ist einfach auszuführen. Sie erfordert nicht mehr als ein Reagenzglas, ein paar einfache Reagenzien und eine Wärmequelle." Der DNA-Fingerabdruck wurde erstmals 1988 für Vaterschaftstests verwendet. ⓘ

Mullis hat seinen LSD-Konsum als wesentlich für die Entwicklung der PCR bezeichnet: "Hätte ich die PCR erfunden, wenn ich kein LSD genommen hätte? Ich bezweifle es ernsthaft. Ich konnte auf einem DNA-Molekül sitzen und die Polymere vorbeiziehen sehen. Das habe ich zum Teil auf psychedelischen Drogen gelernt." ⓘ

Mullis und der Biochemiker Michael Smith, der andere wesentliche Methoden zur Manipulation der DNA entwickelt hatte, erhielten 1993 gemeinsam den Nobelpreis für Chemie, sieben Jahre nachdem Mullis und seine Kollegen bei Cetus seinen Vorschlag erstmals in die Praxis umgesetzt hatten. Mullis' Arbeit aus dem Jahr 1985 mit R. K. Saiki und H. A. Erlich, "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" (Enzymatische Amplifikation von β-Globin-Genomsequenzen und Restriktionsstellenanalyse zur Diagnose von Sichelzellenanämie) - die Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - wurde 2017 von der Division of History of Chemistry der American Chemical Society mit einem Citation for Chemical Breakthrough Award ausgezeichnet. ⓘ

Das Herzstück der PCR-Methode ist die Verwendung einer geeigneten DNA-Polymerase, die den hohen Temperaturen von >90 °C standhält, die für die Trennung der beiden DNA-Stränge in der DNA-Doppelhelix nach jedem Replikationszyklus erforderlich sind. Die DNA-Polymerasen, die ursprünglich für In-vitro-Experimente im Vorfeld der PCR eingesetzt wurden, konnten diesen hohen Temperaturen nicht standhalten. Daher waren die frühen Verfahren zur DNA-Replikation sehr ineffizient und zeitaufwändig und erforderten große Mengen an DNA-Polymerase und eine kontinuierliche Handhabung während des gesamten Prozesses. ⓘ

Die Entdeckung der Taq-Polymerase im Jahr 1976 - einer DNA-Polymerase, die aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gereinigt wurde, das natürlicherweise in heißen (50 bis 80 °C) Umgebungen wie heißen Quellen lebt - ebnete den Weg für eine dramatische Verbesserung der PCR-Methode. Die aus T. aquaticus isolierte DNA-Polymerase ist bei hohen Temperaturen stabil und bleibt auch nach der Denaturierung der DNA aktiv, so dass nicht nach jedem Zyklus neue DNA-Polymerase hinzugefügt werden muss. Dies ermöglichte ein automatisiertes Thermocycler-basiertes Verfahren zur DNA-Amplifikation. ⓘ

Patentstreitigkeiten

Das PCR-Verfahren wurde von Kary Mullis patentiert und der Cetus Corporation zugewiesen, bei der Mullis arbeitete, als er das Verfahren 1983 erfand. Das Enzym Taq-Polymerase war ebenfalls durch Patente geschützt. Im Zusammenhang mit dieser Technik gab es mehrere viel beachtete Gerichtsverfahren, darunter eine erfolglose Klage von DuPont. Das Schweizer Pharmaunternehmen Hoffmann-La Roche erwarb 1992 die Rechte an den Patenten. Das letzte der kommerziellen PCR-Patente lief 2017 aus. ⓘ

Ein damit zusammenhängender Patentstreit zwischen Roche und Promega über das Enzym Taq-Polymerase ist noch immer in mehreren Gerichtsbarkeiten weltweit anhängig. Die rechtlichen Auseinandersetzungen gehen über die Laufzeit der ursprünglichen PCR- und Taq-Polymerase-Patente hinaus, die am 28. März 2005 ausliefen. ⓘ

Prinzip

Beispiel

Als allgemeines Beispiel sei hier eine typische Zusammensetzung einer PCR-Reaktion wiedergegeben. Viele Beispiele für die verschiedensten Variationen der PCR finden sich in der wissenschaftlichen Literatur in verschiedensten Kombinationen:

1,0 µl DNA-Lösung (100 ng/µl) ⓘ

2,0 µl Primer (i. d. R. zwei, jeweils 1 µl) (10 pmol/µl)

4,0 µl 10 mmol Desoxy-Nukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), je dNTP 1 µl

5,0 µl 10-fach konzentrierte Polymerase-Pufferlösung

37,0 µl H₂O

1,0 µl Pfu-, Taq- oder andere thermostabile DNA-Polymerase (1–5 U/µl)

50,0 µl Gesamtvolumen

PCR-Optimierung

Verschiedene Methoden können eingesetzt werden, um die Synthesemengen zu steigern oder Inhibitoren der PCR zu beseitigen. ⓘ

Anwendungsgebiete

Die PCR kommt als Methode zur Detektion und Vervielfältigung von DNA-Abschnitten in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten zum Einsatz. ⓘ

Lebensmittelanalytik

Die steigenden Anforderungen von Handel und behördlicher Lebensmittelüberwachung zur Aufklärung und Verhinderung von unlauterem Wettbewerb führten zum Einzug der Technologie in die Lebensmittelanalytik. So kann die PCR zur Identifizierung von Gewürzen in komplexen Lebensmittelmatrizes herangezogen werden. Sie kann auch zur Unterscheidung von Varietäten bei Edelkakao z. B. Criollo und Forastero eingesetzt werden. ⓘ