Viruslast

Die Viruslast, auch als virale Belastung bezeichnet, ist ein numerischer Ausdruck für die Virusmenge in einem bestimmten Flüssigkeitsvolumen, einschließlich biologischer und Umweltproben. Sie ist nicht zu verwechseln mit dem Virustiter, der vom jeweiligen Assay abhängt. Wenn ein Assay zur Messung der infektiösen Viruspartikel durchgeführt wird (Plaque-Assay, Focus-Assay), bezieht sich der Virustiter häufig auf die Konzentration der infektiösen Viruspartikel, die sich von den gesamten Viruspartikeln unterscheidet. Sputum und Blutplasma sind zwei Körperflüssigkeiten, aus denen die Viruslast gemessen wird. Als Beispiel für Umweltproben kann die Viruslast des Norovirus aus dem Abflusswasser von Gartenprodukten bestimmt werden. Das Norovirus hat nicht nur eine verlängerte virale Ausscheidung und die Fähigkeit, in der Umwelt zu überleben, sondern es ist auch eine winzige infektiöse Dosis erforderlich, um eine Infektion beim Menschen auszulösen: weniger als 100 Viruspartikel. ⓘ

Die Viruslast wird oft als Viruspartikel (Virionen) oder infektiöse Partikel pro ml angegeben, je nach Art des Tests. Eine höhere virale Belastung, ein höherer Titer oder eine höhere Viruslast korreliert häufig mit dem Schweregrad einer aktiven Virusinfektion. Die Virusmenge pro ml kann durch Schätzung der lebenden Virusmenge in einer beteiligten Flüssigkeit berechnet werden. Sie kann zum Beispiel in RNA-Kopien pro Milliliter Blutplasma angegeben werden. ⓘ

Die Verfolgung der Viruslast dient der Therapieüberwachung bei chronischen Virusinfektionen und bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem, z. B. bei Patienten, die sich von einer Transplantation von Knochenmark oder festen Organen erholen. Derzeit gibt es Routinetests für HIV-1, Cytomegalovirus, Hepatitis-B-Virus und Hepatitis-C-Virus. Die Überwachung der Viruslast auf HIV ist von besonderem Interesse für die Behandlung von Menschen mit HIV, da dies im Zusammenhang mit der Behandlung von HIV/AIDS immer wieder diskutiert wird. Eine nicht nachweisbare Viruslast bedeutet nicht, dass keine Infektion vorliegt. Bei HIV-positiven Patienten, die eine langfristige antiretrovirale Kombinationstherapie erhalten, kann die Viruslast bei den meisten klinischen Tests nicht nachweisbar sein, da die Konzentration der Viruspartikel unter der Nachweisgrenze (LOD) liegt. ⓘ

Die Viruslast (englisch viral load) ist die Menge eines im Blutserum, Blutplasma, Sputum oder Rachenabstrich gefundenen Virus; sie wird z. B. als Konzentration der Genome (bei DNA-Viren) oder Genomäquivalente (bei RNA-Viren) pro Milliliter angegeben. Bei vielen klinisch wichtigen Viren existieren internationale Standardpräparate zur Kalibrierung der quantitativen Testverfahren. Die Konzentrationsangabe erfolgt als einheitlich, jedoch für das jeweilige Virus zufällig festgelegte IU (International Unit) oder IE (Internationale Einheit) pro Milliliter. Internationale Einheiten können für ein bestimmtes Virus in Genome bzw. Genomäquivalente mit einem fixen Faktor umgerechnet werden. ⓘ

Die Viruslast wird durch quantitative Nachweisverfahren der viralen Nukleinsäure bestimmt, z. B. durch so genannte real-time-PCR, bei RNA-Viren mit einer vorangehenden reversen Transkription. Die Feststellung und Überprüfung der Viruskonzentration sowie ihr zeitlicher Verlauf (Viruskinetik) sind ein wichtiger Bestandteil der Therapiewahl und -überwachung bei chronischen viralen Infektionen sowie bei Patienten mit durch Krankheit, Organtransplantation oder genetisch bedingt geschwächtem Immunsystem. ⓘ

Technologien für Viruslasttests

In einer Übersichtsstudie von Puren et al. aus dem Jahr 2010 werden Viruslasttests in drei Typen eingeteilt: (1) Tests auf der Basis von Nukleinsäureamplifikation (NATs oder NAATs), die in den Vereinigten Staaten mit der Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) kommerziell erhältlich sind oder im Europäischen Wirtschaftsraum (EWR) mit der CE-Kennzeichnung auf dem Markt sind; (2) selbst gebraute" oder hausinterne NATs; (3) nicht auf Nukleinsäure basierende Tests. ⓘ

Nukleinsäure-basierte Tests (NATs)

Es gibt viele verschiedene molekularbasierte Testmethoden zur Quantifizierung der Viruslast mit NATs. Anhand des Ausgangsmaterials für die Amplifikation lassen sich diese molekularen Methoden in drei Gruppen einteilen:

1. Die Target-Amplifikation, bei der die Nukleinsäure selbst verwendet wird. Hier einige der gängigsten Methoden
   • Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einer Methode der In-vitro-DNA-Synthese, werden eine DNA-Vorlage, Polymerase, Puffer, Primer und Nukleotide verwendet, um das HIV in der Blutprobe zu vermehren. Anschließend wird das Virus durch eine chemische Reaktion markiert. Die Marker werden gemessen und zur Berechnung der Virusmenge verwendet. Die PCR wird zur Quantifizierung der integrierten DNA verwendet.
   • Die umgekehrte Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine Variante der PCR, die zur Quantifizierung der viralen RNA verwendet werden kann. Bei dieser Methode wird RNA als Ausgangsmaterial verwendet und mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) für die PCR in doppelsträngige DNA umgewandelt.
   • Die Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikationsmethode (NASBA) ist eine transkriptionsbasierte Amplifikationssystem-Variante (TAS) der PCR. Die RNA wird als Ziel verwendet und eine DNA-Kopie erstellt. Die DNA-Kopie wird dann in RNA transkribiert und amplifiziert. Es gibt mehrere kommerzielle TAS-Varianten, darunter die transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) und die selbstunterhaltende Sequenzreplikation (3SR).
2. Bei der sondenspezifischen Amplifikation werden synthetische Sonden verwendet, die bevorzugt an eine Zielsequenz binden. Die Sonden werden dann vervielfältigt.
3. Bei der Signalamplifikation werden große Mengen von Signalen verwendet, die an ein ursprünglich in der Probe vorhandenes, nicht amplifiziertes Ziel gebunden sind. Eine häufig verwendete Methode:
   • Die Methode der verzweigten DNA (bDNA) kann entweder DNA oder RNA als Zielnukleinsäure verwenden. Kurze Sonden werden an einen festen Träger gebunden und fangen die Zielnukleinsäure ein. Zusätzliche Extender-Sonden binden ebenfalls an die Zielnukleinsäure und an zahlreiche Reportermoleküle, die zur Erhöhung der Signalintensität verwendet werden, die in eine Viruszahl umgerechnet wird. ⓘ

Plasmaproben

EDTA-Plasma ist eine gute Quelle für zellfreie virale RNA für RNA-basierte Viruslasttests. Die Entnahme und Lagerung der Proben sowie Maßnahmen zur biologischen Sicherheit müssen unbedingt beachtet werden. Die Extraktion von RNA aus Plasma erfordert spezielle Geräte, Reagenzien und Schulungen, was für mittlere bis kleine Labors mit begrenzten Ressourcen unerschwinglich ist. Für einen linearen Bereich, der bei 50 Kopien/ml seinen Tiefpunkt erreicht, wird eine große Probe (> 1 ml Plasma) benötigt, was eine Venenpunktion erfordert. Dieser lineare Bereich eignet sich am besten für die Behandlungsüberwachung. Wenn ein höherer linearer Bereich von mehr als 1000 Kopien/ml akzeptabel ist, würde ein Fingerstich eine ausreichende Probe für die Diagnose einer HIV-Infektion im Säuglingsalter liefern. ⓘ

Lagerung

EDTA-Plasma kann 30 Stunden bei Raumtemperatur, 14 Tage bei 4 °C und längere Zeit bei -70 °C gelagert werden, ohne dass es zu einer signifikanten Abnahme der Viruslast kommt. Die RNA in kleineren Blutproben, wie z. B. getrockneten Plasmaproben (DPS) oder getrockneten Blutflecken (DBS) aus Fingersticks, ist Berichten zufolge bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 4 Wochen bis zu einem Jahr stabil. Das Virus wird in getrockneten Proben inaktiviert, was die Gefahr bei der Handhabung der Proben verringert. DBS und DPS wurden erfolgreich für Viruslasttests evaluiert, aber ihr linearer Bereich liegt bei 3 log10 oder 4 log10 Kopien/ml. Aufgrund dieser mangelnden Empfindlichkeit sind getrocknete Proben zwar für das HIV-Screening, nicht aber für die Bestimmung der Viruslast geeignet. ⓘ

Messung

Die Viruslast wird normalerweise als HIV-Kopien in einem Milliliter (mL) Blut angegeben. Veränderungen der Viruslast werden in der Regel als logarithmische Veränderung (in Potenzen von 10) angegeben. Ein Anstieg der Viruslast um drei Logarithmen (3 log10) entspricht beispielsweise einem Anstieg um das 10³- oder 1.000-fache des zuvor gemeldeten Wertes, während ein Rückgang von 500.000 auf 500 Kopien einen Rückgang um drei Logarithmen (ebenfalls 3 log10) bedeuten würde. ⓘ

Andere Faktoren, die die Viruslast beeinflussen

Unterschiedliche Testmethoden liefern oft unterschiedliche Ergebnisse für dieselbe Patientenprobe. Um vergleichbar zu sein, sollte bei jeder Patientenprobe dieselbe Testmethode (Zielamplifikation, sondenspezifische Amplifikation oder Signalamplifikation) verwendet werden. Idealerweise sollten die Patiententests im selben medizinischen Labor unter Verwendung desselben Viruslasttests und Analysegeräts durchgeführt werden. Tageszeit, Müdigkeit und Stress können die Viruslastwerte ebenfalls beeinflussen. Kürzlich erfolgte Impfungen oder Infektionen können den Viruslasttest beeinträchtigen. Die Tests sollten mindestens vier Wochen nach einer Impfung oder Infektion verschoben werden. ⓘ