Plasmid
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Ein Plasmid ist ein kleines, extrachromosomales DNA-Molekül in einer Zelle, das physisch von der chromosomalen DNA getrennt ist und sich unabhängig replizieren kann. Am häufigsten sind sie als kleine zirkuläre, doppelsträngige DNA-Moleküle in Bakterien zu finden; Plasmide kommen jedoch auch in Archaeen und eukaryotischen Organismen vor. In der Natur sind Plasmide häufig Träger von Genen, die dem Überleben des Organismus zugute kommen und einen Selektionsvorteil wie z. B. eine Antibiotikaresistenz verleihen. Während Chromosomen groß sind und alle wesentlichen genetischen Informationen für das Leben unter normalen Bedingungen enthalten, sind Plasmide in der Regel sehr klein und enthalten nur zusätzliche Gene, die in bestimmten Situationen oder unter bestimmten Bedingungen nützlich sein können. Künstliche Plasmide werden häufig als Vektoren bei der molekularen Klonierung verwendet und dienen dazu, die Replikation rekombinanter DNA-Sequenzen in Wirtsorganismen zu steuern. Im Labor können Plasmide durch Transformation in eine Zelle eingeführt werden. Synthetische Plasmide sind über das Internet erhältlich. ⓘ
Plasmide gelten als Replikons, d. h. als DNA-Einheiten, die in der Lage sind, sich in einem geeigneten Wirt selbständig zu vermehren. Plasmide werden jedoch, wie Viren, im Allgemeinen nicht als Leben eingestuft. Plasmide werden vor allem durch Konjugation von einem Bakterium auf ein anderes (auch einer anderen Art) übertragen. Diese Übertragung von genetischem Material von Wirt zu Wirt ist ein Mechanismus des horizontalen Gentransfers, und Plasmide werden als Teil des Mobiloms betrachtet. Im Gegensatz zu Viren, die ihr genetisches Material in eine schützende Proteinhülle, das so genannte Kapsid, einschließen, sind Plasmide "nackte" DNA und kodieren keine Gene, die zur Umhüllung des genetischen Materials für die Übertragung auf einen neuen Wirt erforderlich sind; einige Plasmidklassen kodieren jedoch den konjugativen "Sex"-Pilus, der für ihre eigene Übertragung erforderlich ist. Die Größe der Plasmide variiert von 1 bis über 400 kbp, und die Zahl der identischen Plasmide in einer einzigen Zelle kann unter Umständen von einem bis zu Tausenden reichen. ⓘ
Plasmide sind kleine, in der Regel ringförmige, autonom replizierende, doppelsträngige DNA-Moleküle, die in Bakterien und in Archaeen vorkommen können, aber nicht zum Bakterienchromosom (Kernäquivalent) zählen, also extrachromosomal vorliegen (Abb. 1). Sie werden daher auch als extrachromosomale Elemente (ECEs) bezeichnet. Nur selten treten Plasmide auch in Eukaryoten auf (z. B. als 2-Mikrometer-Ring in Backhefe). Ihre Größe beträgt meist zwischen 2 kBp und 200 kBp, in Ausnahmefällen zwischen weniger als 1 kBp (Miniplasmid) und über 1000 kBp (Megaplasmid), wobei der Übergang zwischen Megaplasmid und Minichromosom fließend ist. Analoge extrachromosomale DNA in Archaeen sind Borgs. ⓘ
Geschichte
Der Begriff Plasmid wurde 1952 von dem amerikanischen Molekularbiologen Joshua Lederberg eingeführt und bezeichnete "jede extrachromosomale erbliche Determinante". Da diese Beschreibung jedoch auch bakterielle Viren einschließt, wurde der Begriff Plasmid im Laufe der Zeit dahingehend verfeinert, dass er auch genetische Elemente umfasst, die sich eigenständig vermehren. Später, im Jahr 1968, wurde beschlossen, den Begriff Plasmid als Bezeichnung für extrachromosomale genetische Elemente zu übernehmen, und zur Unterscheidung von Viren wurde die Definition auf genetische Elemente eingegrenzt, die ausschließlich oder überwiegend außerhalb des Chromosoms existieren und sich autonom replizieren können. ⓘ
Eigenschaften und Merkmale
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Damit sich Plasmide innerhalb einer Zelle selbständig vermehren können, müssen sie einen DNA-Abschnitt besitzen, der als Replikationsursprung dienen kann. Die selbstreplizierende Einheit, in diesem Fall das Plasmid, wird als Replikon bezeichnet. Ein typisches bakterielles Replikon kann aus einer Reihe von Elementen bestehen, z. B. dem Gen für das plasmidspezifische Replikationsinitiationsprotein (Rep), sich wiederholenden Einheiten, die Iterons genannt werden, DnaA-Boxen und einer angrenzenden AT-reichen Region. Kleinere Plasmide nutzen die Replikationsenzyme des Wirts, um Kopien von sich selbst herzustellen, während größere Plasmide spezifische Gene für die Replikation dieser Plasmide tragen können. Einige Arten von Plasmiden können sich auch in das Wirts-Chromosom einfügen, und diese integrativen Plasmide werden bei Prokaryoten manchmal als Episomen bezeichnet. ⓘ
Plasmide tragen fast immer mindestens ein Gen. Viele der von einem Plasmid getragenen Gene sind für die Wirtszellen von Vorteil, z. B. ermöglichen sie der Wirtszelle das Überleben in einer Umgebung, die ansonsten tödlich oder wachstumshemmend wäre. Einige dieser Gene kodieren Eigenschaften für die Antibiotikaresistenz oder die Resistenz gegen Schwermetalle, während andere Virulenzfaktoren erzeugen können, die es einem Bakterium ermöglichen, einen Wirt zu besiedeln und dessen Abwehrkräfte zu überwinden, oder spezifische Stoffwechselfunktionen haben, die es dem Bakterium ermöglichen, einen bestimmten Nährstoff zu verwerten, einschließlich der Fähigkeit, widerspenstige oder toxische organische Verbindungen abzubauen. Plasmide können Bakterien auch die Fähigkeit verleihen, Stickstoff zu fixieren. Einige Plasmide haben jedoch keine erkennbare Auswirkung auf den Phänotyp der Wirtszelle, oder ihr Nutzen für die Wirtszellen lässt sich nicht feststellen; diese Plasmide werden als kryptische Plasmide bezeichnet. ⓘ
Natürlich vorkommende Plasmide unterscheiden sich stark in ihren physikalischen Eigenschaften. Ihre Größe kann von sehr kleinen Miniplasmiden von weniger als 1 Kilobasenpaar (kbp) bis zu sehr großen Megaplasmiden von mehreren Megabasenpaaren (Mbp) reichen. Im oberen Bereich gibt es kaum Unterschiede zwischen einem Megaplasmid und einem Minichromosom. Plasmide sind im Allgemeinen zirkulär, aber es sind auch Beispiele für lineare Plasmide bekannt. Diese linearen Plasmide erfordern spezielle Mechanismen zur Replikation ihrer Enden. ⓘ
Plasmide können in einer einzelnen Zelle in unterschiedlicher Anzahl vorhanden sein, die von einem bis zu mehreren hundert reicht. Die normale Anzahl der Plasmidkopien in einer einzelnen Zelle wird als Plasmidkopienzahl bezeichnet und hängt davon ab, wie die Replikationsinitiierung reguliert wird und wie groß das Molekül ist. Größere Plasmide haben in der Regel eine geringere Kopienzahl. Plasmide mit geringer Kopienzahl, die nur in einer oder wenigen Kopien in jedem Bakterium vorhanden sind, laufen bei der Zellteilung Gefahr, in einem der segregierenden Bakterien verloren zu gehen. Solche Einzelkopie-Plasmide verfügen über Systeme, die versuchen, aktiv eine Kopie auf beide Tochterzellen zu verteilen. Diese Systeme, zu denen das parABS-System und das parMRC-System gehören, werden häufig als Partitionssystem oder Partitionsfunktion eines Plasmids bezeichnet. ⓘ
Klassifizierungen und Typen
Plasmide können auf verschiedene Weise klassifiziert werden. Plasmide lassen sich grob in konjugative Plasmide und nicht-konjugative Plasmide einteilen. Konjugative Plasmide enthalten eine Reihe von Transfergenen, die die sexuelle Konjugation zwischen verschiedenen Zellen fördern. In dem komplexen Prozess der Konjugation können Plasmide von einem Bakterium auf ein anderes über Sexualpili übertragen werden, die von einigen der Transfergene kodiert werden (siehe Abbildung). Nicht-konjugative Plasmide sind nicht in der Lage, eine Konjugation einzuleiten und können daher nur mit Hilfe konjugativer Plasmide übertragen werden. Eine Zwischenklasse von Plasmiden ist mobilisierbar und trägt nur eine Teilmenge der für den Transfer erforderlichen Gene. Sie können ein konjugatives Plasmid parasitieren und nur in dessen Anwesenheit mit hoher Frequenz übertragen werden. ⓘ
Plasmide können auch in Inkompatibilitätsgruppen eingeteilt werden. Eine Mikrobe kann verschiedene Arten von Plasmiden beherbergen, aber verschiedene Plasmide können nur in einer einzigen Bakterienzelle existieren, wenn sie kompatibel sind. Wenn zwei Plasmide nicht kompatibel sind, geht das eine oder das andere schnell aus der Zelle verloren. Verschiedene Plasmide können daher verschiedenen Inkompatibilitätsgruppen zugeordnet werden, je nachdem, ob sie miteinander koexistieren können. Inkompatible Plasmide (die zur gleichen Inkompatibilitätsgruppe gehören) haben normalerweise die gleichen Replikations- oder Teilungsmechanismen und können daher nicht zusammen in einer Zelle gehalten werden. ⓘ
Eine weitere Möglichkeit, Plasmide zu klassifizieren, ist ihre Funktion. Es gibt fünf Hauptklassen:
- Fruchtbarkeit F-Plasmide, die Tra-Gene enthalten. Sie sind zur Konjugation fähig und führen zur Bildung von Sexualpili.
- Resistenzplasmide (R-Plasmide), die Gene enthalten, die eine Resistenz gegen Antibiotika oder Gifte vermitteln. In der Vergangenheit wurden sie als R-Faktoren bezeichnet, bevor die Natur der Plasmide verstanden wurde.
- Col-Plasmide, die Gene enthalten, die für Bakteriocine kodieren, Proteine, die andere Bakterien abtöten können.
- Abbauplasmide, die den Abbau ungewöhnlicher Stoffe ermöglichen, z. B. Toluol und Salicylsäure.
- Virulenzplasmide, die das Bakterium zu einem Krankheitserreger machen, z. B. das Ti-Plasmid in Agrobacterium tumefaciens ⓘ
Plasmide können zu mehr als einer dieser Funktionsgruppen gehören. ⓘ
Eine besondere Art von Plasmiden stellen die sog. Ti-Plasmide (Tumor inducing) dar, die eine Transfer-DNA übertragen. Sie sind oft ein Bestandteil von bestimmten Bakterien (Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes) und werden von diesen in Pflanzen übertragen. Dort verursachen sie die einzige bekannte Krebserkrankung in Pflanzen. ⓘ
Ein weiteres besonderes Plasmid ist pR1SE von Halobacterium lacusprofundi R1S1, gefunden 2017 in der Antarktis. Dieses ist in der Lage, Vesikel (Schutzblasen) auszubilden. Es wird diskutiert, ob pR1SE eine Übergangs- oder Zwischenform zu Viren darstellen könnte. ⓘ
Plasmide vom Typ IncP1 können von Bakterien auf Organismen aller drei Domänen übertragen werden (englisch trans-kingdom conjugation, TKC – sic! – zwischen Organismen verschiedener Domänen). ⓘ
RNA-Plasmide
Obwohl die meisten Plasmide doppelsträngige DNA-Moleküle sind, bestehen einige aus einzelsträngiger DNA oder überwiegend aus doppelsträngiger RNA. RNA-Plasmide sind nicht-infektiöse extrachromosomale lineare RNA-Replikone, sowohl verkapselt als auch nicht verkapselt, die in Pilzen und verschiedenen Pflanzen, von Algen bis zu Landpflanzen, gefunden wurden. In vielen Fällen kann es jedoch schwierig oder unmöglich sein, RNA-Plasmide eindeutig von RNA-Viren und anderen infektiösen RNAs zu unterscheiden. ⓘ
Vektoren
Künstlich hergestellte Plasmide können als Vektoren in der Gentechnik verwendet werden. Diese Plasmide dienen als wichtige Hilfsmittel in Genetik- und Biotechnologielabors, wo sie häufig zum Klonen und Amplifizieren (Anfertigen vieler Kopien) oder zur Expression bestimmter Gene verwendet werden. Für diese Zwecke ist eine Vielzahl von Plasmiden im Handel erhältlich. Das zu vervielfältigende Gen wird normalerweise in ein Plasmid eingefügt, das in der Regel eine Reihe von Merkmalen für seine Verwendung enthält. Dazu gehören ein Gen, das eine Resistenz gegen bestimmte Antibiotika verleiht (Ampicillin wird am häufigsten für Bakterienstämme verwendet), ein Replikationsursprung, der es den Bakterienzellen ermöglicht, die Plasmid-DNA zu replizieren, und eine geeignete Stelle für die Klonierung (eine so genannte multiple Klonierungsstelle). ⓘ
Die strukturelle Instabilität der DNA kann als eine Reihe spontaner Ereignisse definiert werden, die in einer unvorhergesehenen Umlagerung, einem Verlust oder einer Zunahme von genetischem Material gipfeln. Solche Ereignisse werden häufig durch die Transposition mobiler Elemente oder durch das Vorhandensein instabiler Elemente wie nicht-kanonischer (Nicht-B-)Strukturen ausgelöst. Akzessorische Regionen, die zum bakteriellen Rückgrat gehören, können an einer Vielzahl von Phänomenen struktureller Instabilität beteiligt sein. Zu den bekannten Katalysatoren genetischer Instabilität gehören direkte, invertierte und Tandem-Wiederholungen, die in vielen kommerziell erhältlichen Klonierungs- und Expressionsvektoren auffällig sind. Auch Insertionssequenzen können die Plasmidfunktion und -ausbeute stark beeinträchtigen, indem sie zu Deletionen und Umlagerungen, Aktivierung, Herunterregulierung oder Inaktivierung der Expression benachbarter Gene führen. Daher würde die Verringerung oder vollständige Beseitigung fremder, nicht kodierender Sequenzen im Rückgrat die Neigung zu solchen Ereignissen und folglich das rekombinogene Potenzial des Plasmids insgesamt deutlich verringern. ⓘ
Klonen
Plasmide sind die am häufigsten verwendeten bakteriellen Klonierungsvektoren. Diese Klonierungsvektoren enthalten eine Stelle, an der DNA-Fragmente eingefügt werden können, z. B. eine multiple Klonierungsstelle oder einen Polylinker, der mehrere häufig verwendete Restriktionsstellen aufweist, an die DNA-Fragmente ligiert werden können. Nach dem Einfügen des gewünschten Gens werden die Plasmide durch einen Transformationsprozess in Bakterien eingeführt. Diese Plasmide enthalten einen selektierbaren Marker, in der Regel ein Antibiotikaresistenzgen, das den Bakterien die Fähigkeit verleiht, in einem selektiven Wachstumsmedium, das das jeweilige Antibiotikum enthält, zu überleben und sich zu vermehren. Die Zellen werden nach der Transformation dem Selektivmedium ausgesetzt, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können überleben. Auf diese Weise wirken die Antibiotika wie ein Filter, der nur die Bakterien auswählt, die die Plasmid-DNA enthalten. Der Vektor kann auch andere Markergene oder Reportergene enthalten, um die Selektion von Plasmiden mit klonierten Inserts zu erleichtern. Bakterien, die das Plasmid enthalten, können dann in großen Mengen gezüchtet und geerntet werden, und das Plasmid von Interesse kann dann mit verschiedenen Methoden der Plasmidpräparation isoliert werden. ⓘ
Ein Plasmid-Klonierungsvektor wird in der Regel zum Klonen von DNA-Fragmenten von bis zu 15 kbp verwendet. Zur Klonierung längerer DNA-Fragmente werden Lambda-Phagen, bei denen die Lysogenese-Gene entfernt wurden, Kosmide, bakterielle künstliche Chromosomen oder künstliche Hefechromosomen verwendet. ⓘ
Herstellung von Proteinen
Eine weitere wichtige Anwendung von Plasmiden ist die Herstellung großer Mengen von Proteinen. In diesem Fall züchten die Forscher Bakterien, die ein Plasmid enthalten, das das gewünschte Gen beherbergt. So wie das Bakterium Proteine produziert, um seine Antibiotikaresistenz zu verleihen, kann es auch dazu gebracht werden, große Mengen an Proteinen aus dem eingefügten Gen zu produzieren. Dies ist eine billige und einfache Möglichkeit, das Protein, für das das Gen kodiert, in großen Mengen zu produzieren, zum Beispiel Insulin. ⓘ
Gentherapie
Plasmide können auch für den Gentransfer als potenzielle Behandlung in der Gentherapie verwendet werden, damit sie das in den Zellen fehlende Protein exprimieren können. Einige Formen der Gentherapie erfordern das Einfügen therapeutischer Gene an vorher ausgewählten chromosomalen Zielstellen im menschlichen Genom. Plasmidvektoren sind einer von vielen Ansätzen, die zu diesem Zweck verwendet werden können. Zinkfingernukleasen (ZFN) bieten eine Möglichkeit, einen ortsspezifischen Doppelstrangbruch im DNA-Genom zu verursachen und eine homologe Rekombination auszulösen. Plasmide, die für ZFN kodieren, könnten dabei helfen, ein therapeutisches Gen an eine bestimmte Stelle zu bringen, so dass Zellschäden, krebsverursachende Mutationen oder eine Immunreaktion vermieden werden. ⓘ
Krankheitsmodelle
In der Vergangenheit wurden Plasmide verwendet, um die embryonalen Stammzellen von Ratten gentechnisch zu verändern und so genetische Krankheitsmodelle für Ratten zu schaffen. Die begrenzte Effizienz der plasmidbasierten Techniken schloss ihren Einsatz bei der Schaffung genauerer menschlicher Zellmodelle aus. Die Entwicklung von Rekombinationstechniken mit adeno-assoziierten Viren und Zinkfingernukleasen hat jedoch die Schaffung einer neuen Generation von isogenen menschlichen Krankheitsmodellen ermöglicht. ⓘ
Episomen
Der Begriff Episom wurde 1958 von François Jacob und Élie Wollman eingeführt, um extrachromosomales genetisches Material zu bezeichnen, das sich eigenständig replizieren oder in das Chromosom integriert werden kann. Seit der Einführung des Begriffs hat sich seine Verwendung jedoch geändert, da Plasmid die bevorzugte Bezeichnung für autonom replizierende extrachromosomale DNA geworden ist. Auf einem Symposium in London im Jahr 1968 schlugen einige Teilnehmer vor, den Begriff Episom aufzugeben, obwohl andere den Begriff mit einer Bedeutungsverschiebung weiter verwendeten. ⓘ
Heute verwenden einige Autoren den Begriff Episom im Zusammenhang mit Prokaryonten als Bezeichnung für ein Plasmid, das in das Chromosom integriert werden kann. Die integrativen Plasmide können in einer Zelle über mehrere Generationen hinweg repliziert und stabil gehalten werden, aber irgendwann existieren sie als unabhängiges Plasmidmolekül. Im Zusammenhang mit Eukaryoten wird der Begriff Episom für ein nicht integriertes extrachromosomales geschlossenes zirkuläres DNA-Molekül verwendet, das im Zellkern repliziert werden kann. Viren sind die häufigsten Beispiele dafür, wie Herpesviren, Adenoviren und Polyomaviren, aber auch Plasmide. Andere Beispiele sind abweichende Chromosomenfragmente, wie doppelte winzige Chromosomen, die bei künstlichen Genamplifikationen oder bei pathologischen Prozessen (z. B. bei der Transformation von Krebszellen) entstehen können. Episomen in Eukaryonten verhalten sich ähnlich wie Plasmide in Prokaryonten, da die DNA in der Wirtszelle stabil gehalten und repliziert wird. Zytoplasmatische virale Episomen (wie bei Pockenvirusinfektionen) können ebenfalls auftreten. Einige Episomen, wie z. B. Herpesviren, replizieren sich in einem Rolling-Circle-Mechanismus, ähnlich wie Bakteriophagen (bakterielle Phagenviren). Andere replizieren sich durch einen bidirektionalen Replikationsmechanismus (Plasmide vom Typ Theta). In beiden Fällen bleiben die Episomen physisch von den Chromosomen der Wirtszelle getrennt. Mehrere Krebsviren, darunter das Epstein-Barr-Virus und das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus, bleiben als latente, chromosomal getrennte Episomen in Krebszellen erhalten, wo die Viren Onkogene exprimieren, die die Vermehrung der Krebszellen fördern. In Krebszellen replizieren diese Episomen passiv zusammen mit den Wirtschromosomen, wenn sich die Zelle teilt. Wenn diese viralen Episomen eine lytische Replikation einleiten, um mehrere Viruspartikel zu erzeugen, aktivieren sie im Allgemeinen zelluläre Abwehrmechanismen der angeborenen Immunität, die die Wirtszelle abtöten. ⓘ
Wartung von Plasmiden
Einige Plasmide oder mikrobielle Wirte verfügen über ein Suchtsystem oder ein postsegregationales Tötungssystem (PSK), wie das hok/sok-System (host killing/suppressor of killing) des Plasmids R1 in Escherichia coli. Diese Variante produziert sowohl ein langlebiges Gift als auch ein kurzlebiges Gegengift. In der Literatur wurden verschiedene Arten von Plasmid-Abhängigkeitssystemen (Toxin/Antitoxin, stoffwechselbasierte Systeme, ORT-Systeme) beschrieben und in biotechnischen (Fermentation) oder biomedizinischen (Impfstofftherapie) Anwendungen eingesetzt. Tochterzellen, die eine Kopie des Plasmids behalten, überleben, während eine Tochterzelle, die das Plasmid nicht erbt, stirbt oder aufgrund des verbleibenden Giftes der Mutterzelle eine verringerte Wachstumsrate aufweist. Schließlich könnte die Gesamtproduktivität gesteigert werden. ⓘ
Im Gegensatz dazu enthalten die in der Biotechnologie verwendeten Plasmide wie pUC18, pBR322 und abgeleitete Vektoren kaum Toxin-Antitoxin-Suchtsysteme und müssen daher unter Antibiotikadruck gehalten werden, um einen Plasmidverlust zu vermeiden. ⓘ
Hefe-Plasmide
Hefen beherbergen von Natur aus verschiedene Plasmide. Dazu gehören insbesondere 2 μm-Plasmide - kleine zirkuläre Plasmide, die häufig für die gentechnische Veränderung von Hefe verwendet werden - und lineare pGKL-Plasmide aus Kluyveromyces lactis, die für Killerphänotypen verantwortlich sind. ⓘ
Andere Arten von Plasmiden sind häufig mit Hefeklonierungsvektoren verwandt, zu denen folgende gehören:
- Hefe-Integrationsplasmid (YIp), Hefevektoren, die auf die Integration in das Wirtschromosom angewiesen sind, um zu überleben und sich zu vermehren, und die in der Regel verwendet werden, wenn die Funktionalität eines einzelnen Gens untersucht wird oder wenn das Gen toxisch ist. Auch mit dem Gen URA3 verbunden, das ein Enzym für die Biosynthese von Pyrimidin-Nukleotiden (T, C) kodiert;
- Yeast Replicative Plasmid (YRp), das eine Sequenz chromosomaler DNA transportiert, die einen Replikationsursprung enthält. Diese Plasmide sind weniger stabil, da sie während der Knospung verloren gehen können. ⓘ
Extraktion von Plasmid-DNA
Plasmide werden häufig zur Aufreinigung einer bestimmten Sequenz verwendet, da sie leicht vom Rest des Genoms getrennt werden können. Für ihre Verwendung als Vektoren und für das molekulare Klonen müssen Plasmide häufig isoliert werden. ⓘ
Es gibt verschiedene Methoden zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien, von der Miniprep über die Maxiprep bis zur Bulkprep. Ersteres kann verwendet werden, um schnell herauszufinden, ob das Plasmid in einem von mehreren bakteriellen Klonen korrekt ist. Die Ausbeute ist eine kleine Menge unreiner Plasmid-DNA, die für die Analyse durch Restriktionsverdau und für einige Klonierungstechniken ausreichend ist. ⓘ
Bei letzteren werden viel größere Mengen an Bakteriensuspensionen gezüchtet, aus denen eine Maxi-Prep durchgeführt werden kann. Dabei handelt es sich im Wesentlichen um eine vergrößerte Miniprep, gefolgt von einer zusätzlichen Aufreinigung. Das Ergebnis sind relativ große Mengen (mehrere hundert Mikrogramm) an sehr reiner Plasmid-DNA. ⓘ
Es gibt zahlreiche kommerzielle Kits für die Plasmidextraktion in verschiedenen Größenordnungen, Reinheitsgraden und Automatisierungsgraden. ⓘ
Konformationen
Plasmid-DNA kann in einer von fünf Konformationen auftreten, die (bei einer bestimmten Größe) während der Elektrophorese in einem Gel unterschiedlich schnell laufen. Die Konformationen sind nachstehend in der Reihenfolge der elektrophoretischen Mobilität (Geschwindigkeit bei einer bestimmten angelegten Spannung) von der langsamsten bis zur schnellsten aufgeführt:
- Eingeklemmte offen-zirkuläre DNA hat einen Strang abgeschnitten.
- Die entspannte zirkuläre DNA ist völlig intakt, beide Stränge sind ungeschnitten, wurden aber enzymatisch entspannt (Supercoils wurden entfernt). Dies kann man sich vorstellen, indem man ein verdrilltes Verlängerungskabel abwickelt und entspannt und es dann in sich selbst einsteckt.
- Lineare DNA hat freie Enden, entweder weil beide Stränge abgeschnitten wurden oder weil die DNA in vivo linear war. Dies kann mit einem elektrischen Verlängerungskabel nachgebildet werden, das nicht in sich selbst eingesteckt ist.
- Supercoiled-DNA (oder kovalent geschlossene, zirkuläre DNA) ist vollständig intakt, beide Stränge sind ungeschnitten und haben einen integralen Drall, was zu einer kompakten Form führt. Dies kann man sich vorstellen, indem man ein Verlängerungskabel verdreht und dann in sich selbst einsteckt.
- Supercoiled denaturierte DNA ist wie supercoiled DNA, hat aber ungepaarte Bereiche, die sie etwas weniger kompakt machen; dies kann durch übermäßige Alkalität während der Plasmidpräparation entstehen. ⓘ
Die Migrationsrate für kleine lineare Fragmente ist bei niedrigen Spannungen direkt proportional zur angelegten Spannung. Bei höheren Spannungen wandern größere Fragmente mit kontinuierlich steigenden, aber unterschiedlichen Raten. Daher nimmt die Auflösung eines Gels mit steigender Spannung ab. ⓘ
Bei einer bestimmten, niedrigen Spannung ist die Migrationsrate von kleinen linearen DNA-Fragmenten eine Funktion ihrer Länge. Große lineare Fragmente (über 20 kb oder so) wandern unabhängig von ihrer Länge mit einer bestimmten festen Rate. Das liegt daran, dass die Moleküle "atmen", wobei der Großteil des Moleküls dem vorderen Ende durch die Gelmatrix folgt. Restriktionsverdauungen werden häufig zur Analyse gereinigter Plasmide verwendet. Diese Enzyme brechen die DNA spezifisch an bestimmten kurzen Sequenzen. Die resultierenden linearen Fragmente bilden nach der Gelelektrophorese "Banden". Es ist möglich, bestimmte Fragmente zu reinigen, indem man die Banden aus dem Gel herausschneidet und das Gel auflöst, um die DNA-Fragmente freizusetzen. ⓘ
Aufgrund ihrer engen Konformation wandert supercoiled DNA schneller durch ein Gel als lineare oder offen-zirkuläre DNA. ⓘ
Software für Bioinformatik und Design
Die Verwendung von Plasmiden als Technik in der Molekularbiologie wird durch Bioinformatiksoftware unterstützt. Diese Programme zeichnen die DNA-Sequenz von Plasmid-Vektoren auf, helfen bei der Vorhersage von Schnittstellen für Restriktionsenzyme und bei der Planung von Manipulationen. Beispiele für Softwarepakete, die Plasmidkarten bearbeiten, sind ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI und WebDSV. Diese Software hilft bei der Durchführung ganzer Experimente in silico vor der Durchführung von Nassversuchen. ⓘ
Plasmid-Sammlungen
Im Laufe der Jahre wurden viele Plasmide erstellt, und Forscher haben Plasmide an Plasmiddatenbanken wie die gemeinnützigen Organisationen Addgene und BCCM/LMBP abgegeben. In diesen Datenbanken kann man Plasmide finden und für Forschungszwecke anfordern. Forscher laden auch häufig Plasmidsequenzen in die NCBI-Datenbank hoch, aus der die Sequenzen bestimmter Plasmide abgerufen werden können. ⓘ