Chromatographie

Die Dünnschichtchromatographie wird zur Trennung von Bestandteilen eines Pflanzenextrakts verwendet und veranschaulicht den Versuch mit Pflanzenpigmenten, der der Chromatographie ihren Namen gab ⓘ

In der chemischen Analyse ist die Chromatographie eine Labortechnik zur Auftrennung eines Gemisches in seine Bestandteile. Das Gemisch wird in einem flüssigen Lösungsmittel (Gas oder Flüssigkeit), der so genannten mobilen Phase, gelöst und durch ein System (eine Säule, ein Kapillarrohr, eine Platte oder ein Blatt) transportiert, auf dem ein Material, die so genannte stationäre Phase, fixiert ist. Da die verschiedenen Bestandteile des Gemischs eine unterschiedliche Affinität zur stationären Phase aufweisen und je nach ihren Wechselwirkungen mit deren Oberfläche unterschiedlich lange zurückgehalten werden, bewegen sich die Bestandteile mit unterschiedlichen scheinbaren Geschwindigkeiten in der mobilen Flüssigkeit, was zu ihrer Trennung führt. Die Trennung beruht auf der unterschiedlichen Verteilung zwischen der mobilen und der stationären Phase. Geringfügige Unterschiede im Verteilungskoeffizienten einer Verbindung führen zu einer unterschiedlichen Retention an der stationären Phase und beeinflussen somit die Trennung. ⓘ

Die Chromatographie kann präparativ oder analytisch sein. Der Zweck der präparativen Chromatographie besteht darin, die Bestandteile eines Gemischs für die spätere Verwendung zu trennen, und ist somit eine Form der Reinigung. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner Herstellungsweise mit höheren Kosten verbunden. Die analytische Chromatographie wird in der Regel mit kleineren Materialmengen durchgeführt und dient dem Nachweis oder der Messung der relativen Anteile von Analyten in einem Gemisch. Die beiden Arten schließen sich nicht gegenseitig aus. ⓘ

Chromatographische Trennung von Blattfarbstoffen, bei der sowohl die Xanthophylle als auch Chlorophyll a und b jeweils als Banden sichtbar werden. ⓘ

Chromatographie, Chromatografie (griechisch, χρῶμα chroma „Farbe“ und γράφειν graphein „schreiben“, zu deutsch Farbenschreiben) wird in der Chemie ein Verfahren genannt, das die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erlaubt. Dieses Prinzip wurde erstmals 1901 von dem russischen Botaniker Michail Semjonowitsch Zwet beschrieben, 1903 wurde es zum ersten Mal öffentlich gedruckt beschrieben, 1906 benutzte er erstmals den Begriff „Chromatographie“. Er untersuchte gefärbte pflanzliche Extrakte, zum Beispiel aus Blattmaterial, und konnte daraus durch Chromatographie verschiedene Farbstoffe isolieren. Anwendung findet diese Methode zum einen in der Produktion zur Reinigung von Substanzen (= präparative Chromatographie), zum anderen in der chemischen Analytik, um Stoffgemische in möglichst einheitliche Inhaltsstoffe zwecks Identifizierung oder mengenmäßiger Bestimmung aufzutrennen. Die Chromatographie wird in der organischen Chemie, der Pharmazie, der Biochemie, der Biotechnologie, der Mikrobiologie, der Lebensmittelchemie, der Umweltchemie und auch in der anorganischen Chemie angewendet. ⓘ

Etymologie und Aussprache

Chromatografie, ausgesprochen /ˌkroʊməˈtɒɡrəfi/, leitet sich vom griechischen χρῶμα chroma ab, was "Farbe" bedeutet, und γράφειν graphein, was "schreiben" bedeutet. Die Kombination dieser beiden Begriffe geht direkt auf die Erfindung der Technik zurück, mit der erstmals Pigmente getrennt wurden. ⓘ

Geschichte

Die Chromatographie wurde erstmals im Jahr 1900 von dem in Italien geborenen Wissenschaftler Mikhail Tsvet in Russland erfunden. Er entwickelte die Technik und prägte den Begriff Chromatografie im ersten Jahrzehnt des 20. Jahrhunderts, vor allem für die Trennung von Pflanzenpigmenten wie Chlorophyll, Carotin und Xanthophyll. Da sich diese Komponenten in verschiedenfarbigen Banden (grün, orange bzw. gelb) trennen, inspirierten sie direkt den Namen der Technik. Neue Chromatographieverfahren, die in den 1930er und 1940er Jahren entwickelt wurden, machten die Technik für viele Trennverfahren nützlich. ⓘ

Die Technik der Chromatographie wurde in den 1940er und 1950er Jahren durch die Arbeiten von Archer John Porter Martin und Richard Laurence Millington Synge wesentlich weiterentwickelt, für die sie 1952 den Nobelpreis für Chemie erhielten. Sie legten die Grundsätze und grundlegenden Techniken der Trennchromatographie fest, und ihre Arbeit förderte die rasche Entwicklung verschiedener chromatographischer Methoden: Papierchromatographie, Gaschromatographie und die spätere Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Seitdem hat sich die Technologie rasant weiterentwickelt. Forscher fanden heraus, dass die Hauptprinzipien der Chromatographie von Tsvet auf viele verschiedene Arten angewandt werden können, was zu den im Folgenden beschriebenen verschiedenen Arten der Chromatographie führte. Die technische Leistung der Chromatographie wird ständig verbessert und ermöglicht die Trennung von immer ähnlicheren Molekülen. ⓘ

Begriffe aus der Chromatographie

• Analyt - die Substanz, die bei der Chromatographie getrennt werden soll. In der Regel handelt es sich auch um den Stoff, der aus dem Gemisch benötigt wird.
• Analytische Chromatographie - die Verwendung der Chromatographie zur Bestimmung des Vorhandenseins und möglicherweise auch der Konzentration des/der Analyten in einer Probe.
• Gebundene Phase - eine stationäre Phase, die kovalent an die Trägerpartikel oder an die Innenwand des Säulenrohrs gebunden ist.
• Chromatogramm - die visuelle Ausgabe des Chromatographen. Im Falle einer optimalen Trennung entsprechen die verschiedenen Peaks oder Muster auf dem Chromatogramm den verschiedenen Komponenten des getrennten Gemischs. Auf der x-Achse ist die Retentionszeit aufgetragen und auf der y-Achse ein Signal (z. B. von einem Spektralphotometer, Massenspektrometer oder einer Vielzahl anderer Detektoren), das der Reaktion entspricht, die von den Analyten beim Verlassen des Systems erzeugt wird. Im Falle eines optimalen Systems ist das Signal proportional zur Konzentration des spezifischen Analyten, der abgetrennt wird.
• Chromatograph - ein Gerät, das eine anspruchsvolle Trennung ermöglicht, z. B. gaschromatographische oder flüssigkeitschromatographische Trennung.
• Chromatographie - ein physikalisches Trennverfahren, bei dem die Komponenten zwischen zwei Phasen verteilt werden, von denen sich eine stationär (stationäre Phase) und die andere (mobile Phase) in einer bestimmten Richtung bewegt.
• Eluent (manchmal auch Eluierungsmittel genannt) - das Lösungsmittel oder die Lösemittelfixierung, die in der Elutionschromatographie verwendet wird, und ist ein Synonym für die mobile Phase.
• Eluat - das Gemisch aus gelöstem Stoff (siehe Eluite) und Lösungsmittel (siehe Eluent), das die Säule verlässt.
• Effluent - der Strom, der aus einer chromatographischen Säule fließt. In der Praxis wird er synonym mit Eluat verwendet, aber der Begriff bezieht sich genauer auf den Strom, der unabhängig von der stattfindenden Trennung fließt.
• Eluat - ein genauerer Begriff für gelöste Stoffe oder Analyten. Es handelt sich um eine Probenkomponente, die die chromatographische Säule verlässt.
• Eluotrope Reihe - eine Liste von Lösungsmitteln, die nach ihrer Elutionskraft geordnet sind.
• Immobilisierte Phase - eine stationäre Phase, die auf den Trägerpartikeln oder an der Innenwand des Säulenrohrs immobilisiert ist.
• Mobile Phase - die Phase, die sich in eine bestimmte Richtung bewegt. Sie kann eine Flüssigkeit (LC und Kapillarelektrochromatographie (CEC)), ein Gas (GC) oder eine überkritische Flüssigkeit (überkritische Flüssigkeitschromatographie, SFC) sein. Die mobile Phase besteht aus der zu trennenden/analysierenden Probe und dem Lösungsmittel, das die Probe durch die Säule bewegt. Bei der HPLC besteht die mobile Phase aus einem unpolaren Lösungsmittel wie Hexan in der Normalphase oder einem polaren Lösungsmittel wie Methanol in der Umkehrphasenchromatographie und der zu trennenden Probe. Die mobile Phase bewegt sich durch die Chromatographiesäule (die stationäre Phase), wo die Probe mit der stationären Phase in Wechselwirkung tritt und getrennt wird.
• Präparative Chromatographie - die Verwendung der Chromatographie zur Aufreinigung ausreichender Mengen einer Substanz für die weitere Verwendung, nicht für die Analyse.
• Retentionszeit - die charakteristische Zeit, die ein bestimmter Analyt benötigt, um das System (vom Säuleneingang bis zum Detektor) unter festgelegten Bedingungen zu durchlaufen. Siehe auch: Kovats'scher Retentionsindex
• Probe - der Stoff, der in der Chromatographie analysiert wird. Sie kann aus einer einzigen Komponente oder aus einem Gemisch von Komponenten bestehen. Wenn die Probe im Verlauf einer Analyse behandelt wird, wird/werden die Phase(n), die die interessierenden Analyten enthält/enthalten, als Probe bezeichnet, während alles, was nicht von Interesse ist und vor oder im Verlauf der Analyse von der Probe abgetrennt wird, als Abfall bezeichnet wird.
• Solute - die Probenbestandteile in der Partitionschromatographie.
• Lösungsmittel - jede Substanz, die in der Lage ist, eine andere Substanz in Lösung zu bringen, insbesondere die flüssige mobile Phase in der Flüssigkeitschromatographie.
• Stationäre Phase - der Stoff, der für das Chromatographieverfahren fixiert wird. Beispiele sind die Siliziumdioxidschicht in der Dünnschichtchromatographie
• Detektor - das Instrument, das für den qualitativen und quantitativen Nachweis der Analyten nach der Trennung verwendet wird. ⓘ

Die Chromatographie beruht auf dem Konzept des Verteilungskoeffizienten. Jeder gelöste Stoff trennt sich zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmitteln. Wenn wir ein Lösungsmittel unbeweglich (durch Adsorption an eine feste Trägermatrix) und ein anderes beweglich machen, führt dies zu den meisten gängigen Anwendungen der Chromatographie. Wenn die Trägermatrix oder die stationäre Phase polar ist (z. B. Papier, Siliziumdioxid usw.), handelt es sich um Vorwärtsphasenchromatographie, wenn sie unpolar ist (C-18), um Umkehrphasenchromatographie. ⓘ

Techniken nach Form des chromatographischen Bettes

Säulenchromatographie

Die Säulenchromatografie ist eine Trenntechnik, bei der sich das stationäre Bett in einem Rohr befindet. Die Partikel der festen stationären Phase oder des mit einer flüssigen stationären Phase beschichteten Trägers können das gesamte Innenvolumen des Röhrchens ausfüllen (gepackte Säule) oder auf oder entlang der Innenwand des Röhrchens konzentriert sein, wobei im mittleren Teil des Röhrchens ein offener, ungehinderter Weg für die mobile Phase verbleibt (offene Röhrensäule). Unterschiede in der Geschwindigkeit der Bewegung durch das Medium werden zu unterschiedlichen Retentionszeiten der Probe berechnet. 1978 führte W. Clark Still eine modifizierte Version der Säulenchromatographie ein, die Flash-Säulenchromatographie (Flash). Die Technik ist der traditionellen Säulenchromatographie sehr ähnlich, mit dem Unterschied, dass das Lösungsmittel durch Anlegen von Überdruck durch die Säule getrieben wird. Dadurch konnten die meisten Trennungen in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden, wobei die Trennungen im Vergleich zur alten Methode verbessert wurden. Moderne Flash-Chromatographiesysteme werden als vorgepackte Kunststoffkartuschen verkauft, durch die das Lösungsmittel gepumpt wird. Die Systeme können auch mit Detektoren und Fraktionssammlern verbunden werden, was eine Automatisierung ermöglicht. Die Einführung von Gradientenpumpen führte zu schnelleren Trennungen und geringerem Lösungsmittelverbrauch. ⓘ

Bei der Adsorption im expandierten Bett wird ein Wirbelbett anstelle einer festen Phase aus einem Festbett verwendet. Dadurch entfallen die anfänglichen Reinigungsschritte wie Zentrifugation und Filtration für Kulturbrühen oder Aufschlämmungen von aufgebrochenen Zellen. ⓘ

Die Phosphocellulose-Chromatographie macht sich die Bindungsaffinität vieler DNA-bindender Proteine für Phosphocellulose zunutze. Je stärker die Wechselwirkung eines Proteins mit der DNA ist, desto höher ist die Salzkonzentration, die zur Elution des Proteins erforderlich ist. ⓘ

Planare Chromatographie

Bei der planaren Chromatografie handelt es sich um eine Trenntechnik, bei der die stationäre Phase in oder auf einer Ebene liegt. Bei der Ebene kann es sich um ein Papier handeln, das als solches dient oder mit einer Substanz als stationäres Bett imprägniert ist (Papierchromatographie), oder um eine Schicht fester Partikel, die auf einem Träger wie einer Glasplatte aufgebracht ist (Dünnschichtchromatographie). Die verschiedenen Verbindungen im Probengemisch legen unterschiedliche Strecken zurück, je nachdem, wie stark sie mit der stationären Phase im Vergleich zur mobilen Phase wechselwirken. Der spezifische Retentionsfaktor (Rf) einer jeden Chemikalie kann zur Identifizierung einer unbekannten Substanz herangezogen werden. ⓘ

Papierchromatographie

Papierchromatographie in Arbeit ⓘ

Papierchromatographie ⓘ

Bei der Papierchromatografie wird ein kleiner Punkt oder Strich der Probenlösung auf einen Streifen Chromatografiepapier aufgebracht. Das Papier wird in einen Behälter mit einer dünnen Schicht Lösungsmittel gelegt und versiegelt. Wenn das Lösungsmittel durch das Papier aufsteigt, trifft es auf die Probenmischung, die mit dem Lösungsmittel das Papier hinaufwandert. Dieses Papier besteht aus Zellulose, einer polaren Substanz, und die Verbindungen in der Mischung wandern weiter, wenn sie weniger polar sind. Stärker polare Substanzen verbinden sich schneller mit dem Zellulosepapier und wandern daher nicht so weit. ⓘ

Dünnschichtchromatographie (TLC)

Dünnschichtchromatographie ⓘ

Die Dünnschichtchromatografie (TLC) ist eine weit verbreitete Labortechnik zur Trennung verschiedener biochemischer Stoffe auf der Grundlage ihrer relativen Anziehungskraft auf die stationäre und mobile Phase. Sie ist der Papierchromatographie ähnlich. Anstelle einer stationären Phase aus Papier wird jedoch eine stationäre Phase aus einer dünnen Schicht eines Adsorptionsmittels wie Kieselgel, Aluminiumoxid oder Zellulose auf einem flachen, inerten Substrat verwendet. Die TLC ist sehr vielseitig; mehrere Proben können gleichzeitig auf derselben Schicht getrennt werden, was sie sehr nützlich für Screening-Anwendungen macht, z. B. zum Testen von Arzneimittelkonzentrationen und Wasserreinheit. Die Möglichkeit einer Kreuzkontamination ist gering, da jede Trennung auf einer neuen Schicht durchgeführt wird. Im Vergleich zu Papier bietet es den Vorteil schnellerer Durchläufe, besserer Trennungen, besserer quantitativer Analysen und der Wahl zwischen verschiedenen Adsorbentien. Für eine noch bessere Auflösung und schnellere Trennung, bei der weniger Lösungsmittel benötigt werden, kann eine Hochleistungs-TLC verwendet werden. Eine ältere populäre Anwendung war die Unterscheidung von Chromosomen durch Beobachtung des Abstands im Gel (die Trennung war ein separater Schritt). ⓘ

Verdrängungschromatographie

Das Grundprinzip der Verdrängungschromatographie lautet: Ein Molekül mit hoher Affinität für die Chromatographiematrix (der Verdränger) konkurriert effektiv um Bindungsstellen und verdrängt so alle Moleküle mit geringerer Affinität. Es gibt deutliche Unterschiede zwischen Verdrängungs- und Elutionschromatographie. Im Elutionsmodus treten die Substanzen typischerweise in schmalen, gaußförmigen Peaks aus einer Säule aus. Für eine maximale Aufreinigung ist eine breite Trennung der Peaks, vorzugsweise bis zur Basislinie, erwünscht. Die Geschwindigkeit, mit der eine Komponente eines Gemischs im Elutionsmodus die Säule hinunterwandert, hängt von vielen Faktoren ab. Damit sich zwei Substanzen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen und dadurch aufgetrennt werden können, müssen jedoch erhebliche Unterschiede in der Wechselwirkung zwischen den Biomolekülen und der Chromatographiematrix bestehen. Die Betriebsparameter werden so eingestellt, dass die Wirkung dieses Unterschieds maximiert wird. In vielen Fällen kann eine Basislinientrennung der Peaks nur mit Gradientenelution und niedriger Säulenbeladung erreicht werden. Zwei Nachteile der Chromatographie im Elutionsmodus, insbesondere im präparativen Maßstab, sind daher die Komplexität des Betriebs aufgrund des Pumpen von Gradientenlösungsmitteln und der geringe Durchsatz aufgrund der geringen Säulenbeladung. Die Verdrängungschromatographie hat gegenüber der Elutionschromatographie den Vorteil, dass die Komponenten in aufeinanderfolgende Zonen reiner Substanzen und nicht in "Peaks" aufgelöst werden. Da das Verfahren die Nichtlinearität der Isothermen ausnutzt, kann eine größere Säulenbeschickung auf einer bestimmten Säule aufgetrennt werden, wobei die gereinigten Komponenten in deutlich höheren Konzentrationen gewonnen werden. ⓘ

Techniken nach dem physikalischen Zustand der mobilen Phase

Gaschromatographie

Die Gaschromatografie (GC), manchmal auch als Gas-Flüssig-Chromatografie (GLC) bezeichnet, ist eine Trenntechnik, bei der die mobile Phase ein Gas ist. Die gaschromatographische Trennung erfolgt immer in einer Säule, die typischerweise "gepackt" oder "kapillar" ist. Gepackte Säulen sind die Routinearbeitspferde der Gaschromatographie, da sie billiger und einfacher zu verwenden sind und oft eine ausreichende Leistung erbringen. Kapillarsäulen bieten im Allgemeinen eine weitaus bessere Auflösung und werden, obwohl sie teurer sind, immer häufiger eingesetzt, insbesondere für komplexe Gemische. Kapillarsäulen können in drei Klassen unterteilt werden: offene Röhrensäulen mit poröser Schicht (PLOT), offene Röhrensäulen mit Wandbeschichtung (WCOT) und offene Röhrensäulen mit Stützbeschichtung (SCOT). PLOT-Säulen sind insofern einzigartig, als die stationäre Phase an den Säulenwänden adsorbiert ist, während WCOT-Säulen eine stationäre Phase haben, die chemisch an die Wände gebunden ist. SCOT-Säulen sind in gewisser Weise eine Kombination der beiden genannten Säulentypen, da sie Trägerpartikel haben, die an den Säulenwänden haften, an die jedoch eine flüssige Phase chemisch gebunden ist. Beide Säulentypen werden aus nicht adsorbierenden und chemisch inerten Materialien hergestellt. Edelstahl und Glas sind die üblichen Materialien für gepackte Säulen und Quarz oder Quarzglas für Kapillarsäulen. ⓘ

Die Gaschromatographie basiert auf einem Verteilungsgleichgewicht des Analyten zwischen einer festen oder viskosen flüssigen stationären Phase (oft ein flüssiges Material auf Silikonbasis) und einem mobilen Gas (meist Helium). Die stationäre Phase haftet an der Innenseite eines Glas- oder Quarzglasrohrs mit kleinem Durchmesser (in der Regel 0,53 bis 0,18 mm Innendurchmesser) (Kapillarsäule) oder einer festen Matrix in einem größeren Metallrohr (gepackte Säule). Sie ist in der analytischen Chemie weit verbreitet; obwohl die hohen Temperaturen, die in der GC verwendet werden, sie für Biopolymere oder Proteine mit hohem Molekulargewicht, die in der Biochemie häufig vorkommen, ungeeignet machen (Hitze denaturiert sie), eignet sie sich gut für den Einsatz in der Petrochemie, der Umweltüberwachung und -sanierung und der industriellen Chemie. Auch in der chemischen Forschung wird sie in großem Umfang eingesetzt. ⓘ

Flüssigchromatographie

Präparatives HPLC-Gerät ⓘ

Die Flüssigkeitschromatografie (LC) ist ein Trennverfahren, bei dem die mobile Phase eine Flüssigkeit ist. Sie kann entweder in einer Säule oder in einer Ebene durchgeführt werden. Die heutige Flüssigkeitschromatografie, bei der im Allgemeinen sehr kleine Packungspartikel und ein relativ hoher Druck verwendet werden, wird als Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) bezeichnet. ⓘ

Bei der HPLC wird die Probe mit einer Flüssigkeit unter hohem Druck (der mobilen Phase) durch eine Säule gepresst, die mit einer stationären Phase aus unregelmäßig oder kugelförmig geformten Partikeln, einer porösen monolithischen Schicht oder einer porösen Membran gefüllt ist. Monolithen sind "schwammartige chromatografische Medien" und bestehen aus einem unendlichen Block von organischen oder anorganischen Teilen. Die HPLC wird historisch in zwei verschiedene Unterklassen eingeteilt, die sich auf die Polarität der mobilen und stationären Phasen stützen. Verfahren, bei denen die stationäre Phase polarer ist als die mobile Phase (z. B. Toluol als mobile Phase, Siliciumdioxid als stationäre Phase), werden als Normalphasen-Flüssigkeitschromatografie (NPLC) bezeichnet, während das Gegenteil (z. B. Wasser-Methanol-Gemisch als mobile Phase und C18 (Octadecylsilyl) als stationäre Phase) als Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatografie (RPLC) bezeichnet wird. ⓘ

Spezifische Techniken aus diesem Bereich sind im Folgenden aufgeführt. ⓘ

Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie basiert auf der selektiven nicht-kovalenten Wechselwirkung zwischen einem Analyten und spezifischen Molekülen. Sie ist sehr spezifisch, aber nicht sehr robust. Sie wird in der Biochemie häufig zur Reinigung von Proteinen eingesetzt, die an Marker gebunden sind. Diese Fusionsproteine sind mit Verbindungen wie His-Tags, Biotin oder Antigenen markiert, die spezifisch an die stationäre Phase binden. Nach der Reinigung werden diese Markierungen in der Regel entfernt, und man erhält das reine Protein. ⓘ

Bei der Affinitätschromatographie wird häufig die Affinität eines Biomoleküls für ein Metall (Zn, Cu, Fe usw.) genutzt. Die Säulen werden häufig manuell hergestellt. Traditionelle Affinitätssäulen werden als vorbereitender Schritt verwendet, um unerwünschte Biomoleküle auszuspülen. ⓘ

Es gibt jedoch auch Flüssigchromatographietechniken, die sich die Eigenschaften der Affinitätschromatographie zunutze machen. Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) ist nützlich, um die oben genannten Moleküle auf der Grundlage der relativen Affinität für das Metall zu trennen. Häufig können diese Säulen mit verschiedenen Metallen beladen werden, um eine Säule mit einer bestimmten Affinität zu schaffen. ⓘ

Chromatographie mit überkritischer Flüssigkeit

Bei der überkritischen Flüssigkeitschromatografie handelt es sich um eine Trenntechnik, bei der die mobile Phase eine Flüssigkeit ist, die oberhalb und relativ nahe an ihrer kritischen Temperatur und ihrem kritischen Druck liegt. ⓘ

Techniken nach Trennmechanismus

Ionenaustauschchromatographie

Bei der Ionenaustauschchromatografie (gewöhnlich als Ionenchromatografie bezeichnet) wird ein Ionenaustauschmechanismus verwendet, um Analyten auf der Grundlage ihrer jeweiligen Ladungen zu trennen. Sie wird in der Regel in Säulen durchgeführt, kann aber auch im planaren Modus nützlich sein. Bei der Ionenaustauschchromatographie wird eine geladene stationäre Phase verwendet, um geladene Verbindungen wie Anionen, Kationen, Aminosäuren, Peptide und Proteine zu trennen. Bei herkömmlichen Verfahren ist die stationäre Phase ein Ionenaustauscherharz, das geladene funktionelle Gruppen trägt, die mit den entgegengesetzt geladenen Gruppen der zurückzubehaltenden Verbindung wechselwirken. Es gibt zwei Arten der Ionenaustauschchromatographie: Kationen-Austausch und Anionen-Austausch. Bei der Kationenaustausch-Chromatographie ist die stationäre Phase negativ geladen und das austauschbare Ion ist ein Kation, während bei der Anionenaustausch-Chromatographie die stationäre Phase positiv geladen ist und das austauschbare Ion ein Anion ist. Die Ionenaustauschchromatographie wird üblicherweise zur Reinigung von Proteinen mit FPLC verwendet. ⓘ

Größenausschlusschromatographie

Bei der Größenausschlusschromatografie (SEC), die auch als Gelpermeationschromatografie (GPC) oder Gelfiltrationschromatografie bezeichnet wird, werden die Moleküle nach ihrer Größe (genauer gesagt nach ihrem hydrodynamischen Durchmesser oder hydrodynamischen Volumen) getrennt. Kleinere Moleküle können in die Poren des Mediums eindringen, und daher werden Moleküle gefangen und aus dem Fluss der mobilen Phase entfernt. Die durchschnittliche Verweilzeit in den Poren hängt von der effektiven Größe der Analysemoleküle ab. Moleküle, die größer sind als die durchschnittliche Porengröße der Packung, werden jedoch ausgeschlossen und erfahren somit im Wesentlichen keine Retention; solche Spezies werden als erste eluiert. Es handelt sich im Allgemeinen um eine Chromatographietechnik mit geringer Auflösung, die daher oft dem letzten Schritt einer Reinigung vorbehalten ist, dem "Polishing". Sie eignet sich auch zur Bestimmung der Tertiär- und Quartärstruktur von gereinigten Proteinen, zumal sie unter nativen Lösungsbedingungen durchgeführt werden kann. ⓘ

Adsorptionschromatographische Trennung im expandierten Bett

Eine chromatographische Adsorptionskolonne mit expandiertem Bett (EBA) für ein biochemisches Trennverfahren umfasst einen Druckausgleichsflüssigkeitsverteiler mit einer Selbstreinigungsfunktion unter einer porösen Blockiersiebplatte am Boden des expandierten Bettes, eine Oberteil-Düsenbaugruppe mit einer Rückspül-Reinigungsfunktion am oberen Ende des expandierten Bettes, eine bessere Verteilung der in das expandierte Bett eingebrachten Einsatzflüssigkeit, die sicherstellt, dass das durch die Schicht des expandierten Bettes geleitete Fluid einen Zustand der Kolbenströmung aufweist. Die Schicht des expandierten Bettes weist einen Zustand der Kolbenströmung auf. Die chromatographische Trennsäule mit expandiertem Bett hat den Vorteil, dass die Trennleistung des expandierten Bettes erhöht wird. ⓘ

Die Adsorptionschromatographie im expandierten Bett (EBA) ist eine bequeme und wirksame Technik für die Gewinnung von Proteinen direkt aus ungeklärten Rohproben. Bei der EBA-Chromatographie wird das abgesetzte Bett zunächst durch einen Aufwärtsstrom von Äquilibrierungspuffer expandiert. Das Rohmaterial, eine Mischung aus löslichen Proteinen, Verunreinigungen, Zellen und Zelltrümmern, wird dann nach oben durch das expandierte Bett geleitet. Die Zielproteine werden auf dem Adsorptionsmittel festgehalten, während die Partikel und Verunreinigungen durchgelassen werden. Ein Wechsel des Elutionspuffers unter Beibehaltung des Aufwärtsflusses führt zur Desorption des Zielproteins im Expanded-Bed-Modus. Wenn der Fluss umgekehrt wird, setzen sich die adsorbierten Partikel schnell ab, und die Proteine können durch einen Elutionspuffer desorbiert werden. Welcher Modus für die Elution verwendet wird (Expanded-Bed oder Seded-Bed), hängt von den Eigenschaften des Feeds ab. Nach der Elution wird das Adsorptionsmittel mit einer vordefinierten Cleaning-in-Place-Lösung (CIP) gereinigt, und nach der Reinigung wird die Säule entweder regeneriert (zur weiteren Verwendung) oder gelagert. ⓘ

Spezielle Techniken

Umkehrphasenchromatographie

Die Umkehrphasenchromatographie (RPC) ist ein Flüssigchromatographieverfahren, bei dem die mobile Phase deutlich polarer ist als die stationäre Phase. Sie wird so genannt, weil bei der Normalphasen-Flüssigkeitschromatografie die mobile Phase deutlich weniger polar ist als die stationäre Phase. Hydrophobe Moleküle in der mobilen Phase neigen dazu, an der relativ hydrophoben stationären Phase zu adsorbieren. Hydrophile Moleküle in der mobilen Phase neigen dazu, zuerst zu eluieren. Trennsäulen bestehen in der Regel aus einer C8- oder C18-Kohlenstoffkette, die an ein Silikapartikelsubstrat gebunden ist. ⓘ

Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie

Die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist ein Reinigungs- und Analyseverfahren, bei dem Analyten, wie z. B. Proteine, auf der Grundlage hydrophober Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der chromatographischen Matrix getrennt werden. Sie kann einen nicht-denaturierenden, orthogonalen Ansatz zur Umkehrphasentrennung bieten, bei dem die nativen Strukturen und möglicherweise die Proteinaktivität erhalten bleiben. Bei der hydrophoben Interaktionschromatographie wird das Matrixmaterial leicht mit hydrophoben Gruppen substituiert. Diese Gruppen können aus Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Octyl- oder Phenylgruppen bestehen. Bei hohen Salzkonzentrationen "interagieren" die unpolaren Seitenketten auf der Oberfläche der Proteine mit den hydrophoben Gruppen, d. h. beide Gruppenarten werden durch das polare Lösungsmittel ausgeschlossen (die hydrophoben Effekte werden durch eine erhöhte Ionenstärke verstärkt). Die Probe wird also in einem stark polaren Puffer auf die Säule aufgetragen, was eine Assoziation der hydrophoben Flecken auf dem Analyten mit der stationären Phase bewirkt. Bei dem Elutionsmittel handelt es sich in der Regel um einen wässrigen Puffer mit abnehmender Salzkonzentration, zunehmender Konzentration von Detergenzien (die die hydrophoben Wechselwirkungen stören) oder Änderungen des pH-Werts. Von entscheidender Bedeutung ist die Art des verwendeten Salzes, wobei kosmotrope Salze, wie sie in der Hofmeister-Reihe definiert sind, die meiste Wasserstrukturierung um das Molekül und den daraus resultierenden hydrophoben Druck bieten. Zu diesem Zweck wird häufig Ammoniumsulfat verwendet. Der Zusatz von organischen Lösungsmitteln oder anderen weniger polaren Bestandteilen kann zur Verbesserung der Auflösung beitragen. ⓘ

Im Allgemeinen ist die Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) von Vorteil, wenn die Probe empfindlich auf pH-Änderungen oder scharfe Lösungsmittel reagiert, die bei anderen Chromatographietypen üblicherweise verwendet werden, nicht aber auf hohe Salzkonzentrationen. In der Regel wird die Salzmenge im Puffer variiert. Im Jahr 2012 beschrieben Müller und Franzreb die Auswirkungen der Temperatur auf die HIC unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) mit vier verschiedenen Arten von hydrophoben Harzen. In der Studie wurde die Temperatur verändert, um die Bindungsaffinität von BSA an die Matrix zu beeinflussen. Man kam zu dem Schluss, dass eine Temperaturänderung von 50 auf 10 Grad nicht ausreicht, um das gesamte BSA von der Matrix zu waschen, aber sehr effektiv sein kann, wenn die Säule nur einige Male verwendet wird. Die Verwendung von Temperaturänderungen ermöglicht es den Labors, die Kosten für den Kauf von Salz zu senken und Geld zu sparen. ⓘ

Wenn hohe Salzkonzentrationen und Temperaturschwankungen vermieden werden sollen, können Sie ein hydrophoberes Mittel verwenden, das mit Ihrer Probe konkurriert, um sie zu eluieren. [Diese so genannte salzunabhängige HIC-Methode ermöglichte eine direkte Isolierung von menschlichem Immunglobulin G (IgG) aus Serum mit zufriedenstellender Ausbeute und verwendete Beta-Cyclodextrin als Konkurrenten, um IgG aus der Matrix zu verdrängen. Dies eröffnet die Möglichkeit, die HIC auch bei salzempfindlichen Proben einzusetzen, da wir wissen, dass hohe Salzkonzentrationen Proteine ausfallen lassen. ⓘ

Hydrodynamische Chromatographie

Die hydrodynamische Chromatographie (HDC) leitet sich von dem beobachteten Phänomen ab, dass sich große Tröpfchen schneller bewegen als kleine. In einer Säule geschieht dies, weil der Massenschwerpunkt größerer Tröpfchen aufgrund ihrer größeren Gesamtgröße nicht so nahe an den Seiten der Säule liegt wie der kleinerer Tröpfchen. Größere Tröpfchen eluieren zuerst aus der Mitte der Säule, während kleinere Tröpfchen an den Seiten der Säule haften bleiben und zuletzt eluieren. Diese Form der Chromatographie eignet sich für die Trennung von Analyten nach Molmasse, Größe, Form und Struktur, wenn sie in Verbindung mit Lichtstreudetektoren, Viskosimetern und Refraktometern verwendet wird. Die beiden Haupttypen der HDC sind offene Röhren und gepackte Säulen. Die offene Röhre bietet schnelle Trennzeiten für kleine Partikel, während die HDC mit gepackter Säule die Auflösung erhöhen kann und sich besser für Partikel mit einer durchschnittlichen Molekülmasse von mehr als $10^{5}$ Dalton. Die HDC unterscheidet sich von anderen Chromatographieverfahren, da die Trennung nur im interstitiellen Volumen stattfindet, d. h. in dem Volumen, das die Partikel in einer gepackten Säule umgibt und zwischen ihnen liegt. ⓘ

Die HDC hat die gleiche Elutionsreihenfolge wie die Größenausschlusschromatographie (SEC), aber die beiden Verfahren unterscheiden sich dennoch in vielerlei Hinsicht. In einer Studie, in der die beiden Trennungsarten verglichen werden, verwenden Isenberg, Brewer, Côté und Striegel beide Methoden für die Charakterisierung von Polysacchariden und kommen zu dem Schluss, dass HDC in Verbindung mit der Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) im Vergleich zur Offline-MALS eine genauere Molmassenverteilung als die SEC in deutlich kürzerer Zeit erreicht. Dies ist weitgehend darauf zurückzuführen, dass SEC eine destruktivere Technik ist, da die Poren in der Säule den Analyten während der Trennung abbauen, was sich tendenziell auf die Massenverteilung auswirkt. Der Hauptnachteil der HDC ist jedoch die geringe Auflösung der Analytenpeaks, was die SEC zu einer praktikableren Option macht, wenn Chemikalien verwendet werden, die nicht leicht abbaubar sind und bei denen eine schnelle Elution nicht wichtig ist. ⓘ

Die HDC spielt vor allem im Bereich der Mikrofluidik eine wichtige Rolle. Die erste erfolgreiche Vorrichtung für ein HDC-on-a-chip-System wurde 2002 von Chmela et al. vorgeschlagen. Ihr Entwurf konnte mit einem 80 mm langen Kanal Trennungen in einer Zeitspanne von 3 Minuten für Partikel mit Durchmessern von 26 bis 110 nm erzielen, aber die Autoren wiesen auf die Notwendigkeit hin, die Rückhalte- und Dispersionsparameter zu verbessern. In einer Veröffentlichung von Jellema, Markesteijn, Westerweel und Verpoorte aus dem Jahr 2010 führte die Implementierung von HDC mit einem rezirkulierenden bidirektionalen Fluss zu einer hochauflösenden, größenbasierten Trennung mit einem nur 3 mm langen Kanal. Ein so kurzer Kanal und eine so hohe Auflösung wurden als besonders beeindruckend angesehen, wenn man bedenkt, dass frühere Studien Kanäle mit einer Länge von 80 mm verwendet haben. Für eine biologische Anwendung schlugen Huh et al. 2007 eine mikrofluidische Sortiervorrichtung auf der Grundlage von HDC und Schwerkraft vor, die verhindern sollte, dass potenziell gefährliche Partikel mit einem Durchmesser von mehr als 6 Mikrometern bei der Injektion von Kontrastmitteln bei Ultraschalluntersuchungen in den Blutkreislauf gelangen. Diese Studie brachte auch Fortschritte in Bezug auf die Umweltverträglichkeit der Mikrofluidik, da der Fluss nicht durch externe Elektronik angetrieben wird, was ein Vorteil der Verwendung eines auf Schwerkraft basierenden Geräts ist.

Zweidimensionaler Chromatograph GCxGC-TOFMS an der Chemischen Fakultät der GUT Gdańsk, Polen, 2016 ⓘ

Zweidimensionale Chromatographie

In manchen Fällen kann die Selektivität einer Säule nicht ausreichen, um die Analyten in komplexen Proben aufzulösen. Die zweidimensionale Chromatographie zielt darauf ab, die Auflösung dieser Peaks durch Verwendung einer zweiten Säule mit anderen physikalisch-chemischen (chemischen) Eigenschaften zu verbessern. Da sich der Retentionsmechanismus auf diesem neuen festen Träger von dem der erstdimensionalen Trennung unterscheidet, kann es möglich sein, durch zweidimensionale Chromatographie Verbindungen zu trennen, die durch eindimensionale Chromatographie nicht unterscheidbar sind. Außerdem erfolgt die Trennung in der zweiten Dimension schneller als in der ersten Dimension. Ein Beispiel für eine zweidimensionale TLC-Trennung ist, dass die Probe in eine Ecke einer quadratischen Platte getupft, entwickelt, an der Luft getrocknet, dann um 90° gedreht und in der Regel in einem zweiten Lösungsmittelsystem erneut entwickelt wird. Die zweidimensionale Chromatographie kann bei GC- oder LC-Trennungen angewendet werden. Diese Trennmethode kann auch in einem "Heart-Cutting"-Ansatz verwendet werden, bei dem bestimmte Bereiche von Interesse in der ersten Dimension für die Trennung durch die zweite Dimension ausgewählt werden, oder in einem umfassenden Ansatz, bei dem alle Analyten aus der ersten Dimension die Trennung in der zweiten Dimension durchlaufen. ⓘ

Simulierte Wanderbett-Chromatographie

Die Simulated-Moving-Bed-Technik (SMB) ist eine Variante der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie; sie wird eingesetzt, um Partikel und/oder chemische Verbindungen zu trennen, die sonst nur schwer oder gar nicht aufzulösen wären. Diese verbesserte Trennung wird durch eine Ventil- und Säulenanordnung erreicht, die dazu dient, die stationäre Phase unbegrenzt zu verlängern. Bei der Moving-Bed-Technik der präparativen Chromatographie erfolgen die Zufuhr und die Gewinnung des Analyten gleichzeitig und kontinuierlich, aber wegen der praktischen Schwierigkeiten mit einem kontinuierlich bewegten Bett wurde die simulierte Moving-Bed-Technik vorgeschlagen. Bei der simulierten Wanderbetttechnik wird das Bett nicht bewegt, sondern der Probeneingang und der Analytausgang werden kontinuierlich bewegt, so dass der Eindruck eines Wanderbettes entsteht. Die echte Fließbettchromatographie (TMBC) ist nur ein theoretisches Konzept. Ihre Simulation, die SMBC, wird durch die Verwendung einer Vielzahl von in Reihe geschalteten Säulen und einer komplexen Ventilanordnung erreicht, die die Zufuhr von Proben und Lösungsmitteln sowie die Entnahme von Analyten und Abfällen an geeigneten Stellen jeder Säule vorsieht, wodurch es möglich ist, in regelmäßigen Abständen den Probeneingang in eine Richtung und den Lösungsmitteleingang in die entgegengesetzte Richtung zu schalten und dabei auch die Positionen für die Entnahme von Analyten und Abfällen entsprechend zu ändern. ⓘ

Pyrolyse-Gaschromatographie

Pyrolyse-Gaschromatographie-Massenspektrometrie ist eine Methode der chemischen Analyse, bei der die Probe bis zur Zersetzung erhitzt wird, um kleinere Moleküle zu erzeugen, die durch Gaschromatographie getrennt und durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden. ⓘ

Pyrolyse ist die thermische Zersetzung von Materialien in einer inerten Atmosphäre oder im Vakuum. Die Probe wird in direkten Kontakt mit einem Platindraht gebracht oder in ein Quarzprobenrohr gelegt und schnell auf 600-1000 °C erhitzt. Je nach Anwendung werden auch höhere Temperaturen verwendet. In aktuellen Pyrolyseuren werden drei verschiedene Heiztechniken verwendet: Isothermischer Ofen, induktive Heizung (Curie-Punkt-Faden) und Widerstandsheizung mit Platinfäden. Große Moleküle spalten sich an ihren schwächsten Stellen und erzeugen kleinere, flüchtigere Fragmente. Diese Fragmente können durch Gaschromatographie getrennt werden. Pyrolyse-GC-Chromatogramme sind in der Regel komplex, da eine Vielzahl unterschiedlicher Zersetzungsprodukte gebildet wird. Die Daten können entweder als Fingerabdrücke zum Nachweis der Materialidentität verwendet werden, oder die GC/MS-Daten werden zur Identifizierung einzelner Fragmente verwendet, um strukturelle Informationen zu erhalten. Um die Flüchtigkeit der polaren Fragmente zu erhöhen, können einer Probe vor der Pyrolyse verschiedene Methylierungsreagenzien zugesetzt werden. ⓘ

Neben der Verwendung spezieller Pyrolysatoren kann die Pyrolyse fester und flüssiger Proben auch direkt in PTV-Injektoren (Programmable Temperature Vaporizer) durchgeführt werden, die eine schnelle Aufheizung (bis zu 30 °C/s) und hohe Höchsttemperaturen von 600-650 °C ermöglichen. Dies ist für einige Pyrolyseanwendungen ausreichend. Der Hauptvorteil besteht darin, dass kein spezielles Gerät angeschafft werden muss und die Pyrolyse als Teil der routinemäßigen GC-Analyse durchgeführt werden kann. In diesem Fall müssen Quarz-GC-Einlasseinsätze verwendet werden. Es können quantitative Daten gewonnen werden, und es wurden auch gute Ergebnisse der Derivatisierung innerhalb des PTV-Injektors veröffentlicht. ⓘ

Schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie

Die schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) ist eine Form der Flüssigkeitschromatographie, die häufig zur Analyse oder Reinigung von Proteingemischen eingesetzt wird. Wie bei anderen Formen der Chromatografie ist eine Trennung möglich, weil die verschiedenen Bestandteile eines Gemischs unterschiedliche Affinitäten zu zwei Materialien haben, einer sich bewegenden Flüssigkeit (der "mobilen Phase") und einem porösen Feststoff (der stationären Phase). Bei der FPLC ist die mobile Phase eine wässrige Lösung oder ein "Puffer". Die Durchflussmenge des Puffers wird durch eine Verdrängerpumpe gesteuert und normalerweise konstant gehalten, während die Zusammensetzung des Puffers variiert werden kann, indem Flüssigkeiten in unterschiedlichen Anteilen aus zwei oder mehr externen Reservoirs entnommen werden. Bei der stationären Phase handelt es sich um ein Harz, das aus Kügelchen, in der Regel aus vernetzter Agarose, besteht und in einer zylindrischen Glas- oder Kunststoffsäule verpackt ist. FPLC-Harze sind je nach Anwendung in einer breiten Palette von Perlengrößen und Oberflächenliganden erhältlich. ⓘ

Gegenstromchromatographie

Die Gegenstromchromatographie (CCC) ist eine Art der Flüssig-Flüssig-Chromatographie, bei der sowohl die stationäre als auch die mobile Phase flüssig sind und die flüssige stationäre Phase durch eine starke Zentrifugalkraft zum Stillstand gebracht wird. ⓘ

Hydrodynamische Gegenstromchromatographie (CCC)

Das Funktionsprinzip des CCC-Instruments erfordert eine Säule, die aus einem offenen Rohr besteht, das um einen Spulenkörper gewickelt ist. Der Spulenkörper wird in einer zweiachsigen Kreiselbewegung (einer Kardioide) gedreht, wodurch bei jeder Drehung ein variables Schwerefeld (G) auf die Säule einwirkt. Diese Bewegung bewirkt, dass die Säule pro Umdrehung einen Trennungsschritt erfährt und sich die Komponenten der Probe in der Säule aufgrund ihres Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden verwendeten nicht mischbaren flüssigen Phasen trennen. Es gibt heute viele Arten von CCC. Dazu gehören HSCCC (High Speed CCC) und HPCCC (High Performance CCC). HPCCC ist die neueste und leistungsstärkste Version der derzeit verfügbaren Geräte. ⓘ

Zentrifugale Partitionschromatographie (CPC)

Bei der CPC (Zentrifugalpartitionschromatographie oder hydrostatische Gegenstromchromatographie) besteht die Säule aus einer Reihe von Zellen, die durch Kanäle miteinander verbunden sind, die an einem Rotor befestigt sind. Dieser Rotor dreht sich um seine zentrale Achse und erzeugt das Zentrifugalfeld, das notwendig ist, um die stationäre Phase an Ort und Stelle zu halten. Der Trennungsprozess in der CPC wird ausschließlich durch die Verteilung der gelösten Stoffe zwischen der stationären und der mobilen Phase bestimmt, ein Mechanismus, der sich leicht durch die Verteilungskoeffizienten (KD) der gelösten Stoffe beschreiben lässt. CPC-Geräte sind im Handel erhältlich für Trennungen im Labor-, Pilot- und Industriemaßstab mit verschiedenen Säulengrößen, die von etwa 10 Millilitern bis zu 10 Litern Volumen reichen. ⓘ

Periodische Gegenstromchromatographie

Im Gegensatz zur Gegenstromchromatographie (siehe oben) verwendet die periodische Gegenstromchromatographie (PCC) eine feste stationäre Phase und nur eine flüssige mobile Phase. Damit ist sie der herkömmlichen Affinitätschromatographie wesentlich ähnlicher als der Gegenstromchromatographie. Bei der PCC werden mehrere Säulen verwendet, die während der Beladungsphase in Reihe geschaltet sind. Auf diese Weise kann die erste Säule in dieser Reihe überladen werden, ohne dass Produkt verloren geht, das bereits durch die Säule bricht, bevor das Harz vollständig gesättigt ist. Das Durchbruchsprodukt wird auf der/den nachfolgenden Säule(n) aufgefangen. In einem nächsten Schritt werden die Säulen voneinander abgekoppelt. Die erste Säule wird gewaschen und eluiert, während die andere(n) Säule(n) noch beladen wird (werden). Sobald die (anfänglich) erste Säule re-equilibriert ist, wird sie wieder in den Ladestrom eingebracht, allerdings als letzte Säule. Der Prozess wird dann zyklisch fortgesetzt. ⓘ

Chirale Chromatographie

Bei der chiralen Chromatographie werden die Stereoisomere getrennt. Im Falle von Enantiomeren haben diese keine chemischen oder physikalischen Unterschiede, außer dass sie dreidimensionale Spiegelbilder sind. Die herkömmliche Chromatographie oder andere Trennverfahren sind nicht in der Lage, sie zu trennen. Um chirale Trennungen zu ermöglichen, muss entweder die mobile Phase oder die stationäre Phase selbst chiral gemacht werden, was zu unterschiedlichen Affinitäten zwischen den Analyten führt. Chirale Chromatographie HPLC-Säulen (mit einer chiralen stationären Phase) sind sowohl in normaler als auch in umgekehrter Phase im Handel erhältlich. ⓘ

Wässrige Normalphasenchromatographie

Die wässrige Normalphasenchromatographie (ANP) ist durch das Elutionsverhalten des klassischen Normalphasenmodus gekennzeichnet (d. h., die mobile Phase ist deutlich weniger polar als die stationäre Phase), bei dem Wasser eine der Komponenten des Mobilphasen-Lösungsmittelsystems ist. Sie unterscheidet sich von der Flüssigchromatographie mit hydrophiler Wechselwirkung (HILIC) dadurch, dass der Retentionsmechanismus auf Adsorption und nicht auf Verteilung beruht. ⓘ

Anwendungen

Die Chromatographie wird in vielen Bereichen eingesetzt, z. B. in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie, in der chemischen Industrie, in der Forensik, in der Umweltanalyse und in Krankenhäusern. ⓘ

Begrifflichkeiten und Prinzip

Mobile Phase

Phase, in die das Substanzgemisch zu Beginn des Trennsystems eingebracht und die bewegt wird. Bei der Flüssigchromatographie ist die mobile Phase flüssig. Bei der Gaschromatographie kommen Trägergase wie Wasserstoff, Helium oder Stickstoff zum Einsatz, in der Dünnschichtchromatographie spricht man vom Fließmittel. Mobile Phasen unterscheiden sich in ihrer Elutionsfähigkeit („Stärke“ s. u. „Elutrope Reihe“), dies bedingt unterschiedliche Retentionszeiten und oft auch unterschiedliche Selektivitäten. ⓘ

Durchflussvolumen

Das Durchflussvolumen kann direkt aus der Durchflusszeit abgeleitet werden. Es ergibt sich aus der einfachen Formel Durchflussvolumen = Fluss der mobilen Phase · Durchflusszeit. Das Durchflussvolumen ist für zahlreiche Berechnungen in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) sehr wichtig, z. B. für den Methodentransfer zwischen Säulen mit unterschiedlichem Volumen. ⓘ

Elution

Elution (von lat. eluere „auswaschen“) ist das Herauslösen oder Verdrängen von adsorbierten Stoffen aus festen oder mit Flüssigkeit getränkten Adsorbentien und Ionenaustauschern durch kontinuierliche Zugabe eines Lösungsmittels (Elutionsmittel = mobile Phase). Die aus der Trennsäule fließende Lösung wird Eluat genannt. ⓘ

Eine besondere Bedeutung hat dieser Prozess in der Festphasenextraktion. ⓘ

Eluotrope Reihe

Anordnung der als mobile Phase üblichen Lösungsmittel nach ihrer Elutionskraft bei einer Referenzsubstanz (i. d. R. Kieselgel oder Aluminiumoxid). ⓘ

Bluten

Als Bluten wird ein Effekt bei Chromatographie-Säulen bezeichnet, bei dem die Säule geringe Anteile ihrer Matrix verliert. Man spricht auch von Säulenbluten. Ursache für verstärktes Säulenbluten können in der Gaschromatographie eine übermäßige thermische Belastung der Säule und in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) die Verwendung zum Beispiel ungeeigneter pH-Werte des Elutionsmittels oder der Eluenten (zu stark sauer oder alkalisch) sein. Säulenbluten findet in geringem Ausmaß auch im laufenden Betrieb statt und stellt dort normalerweise kein Problem dar. Durch das Säulenbluten ergibt sich, unter anderem, die Alterung von Trennsäulen. Starkes Säulenbluten bewirkt jedoch ein starkes Signalrauschen und einen hohen Hintergrundwert bei der Detektion oder nachgeschalteten Analyseverfahren, wie einem Massenspektrometer. ⓘ

Säule

In der Chromatographie versteht man unter einer Säule, oder Trennsäule, eine hohle Röhre mit einem Durchmesser von wenigen Mikrometern bis zu mehreren Metern. Auch die Länge variiert von wenigen Zentimetern bis zu 150 Metern. In dieser Röhre ist entweder nur die Innenwand beschichtet (Kapillarsäule), oder die Säule ist mit der stationären Phase befüllt (gepackte Säule). Von der Säule im Bauwesen unterscheidet sie sich insofern, als sie weder gerade noch senkrecht sein muss, sondern auch wie ein Schlauch aufgerollt sein kann. ⓘ

Kenngrößen der Chromatographie

• Säulenlänge $L$ ⓘ

• Durchflusszeit $t_{0}$ ⓘ

• Retentionszeit $t_{R}$ ⓘ

• $u$ nennt man die lineare Durchflussgeschwindigkeit der mobilen Phase durch die Säule, sie ist definiert als:

$u={\frac {L}{t_{0}}}$ ⓘ

• der Retentionsfaktor $k$ ist definiert durch ⓘ

$k={\frac {t_{R}-t_{0}}{t_{0}}}$ ⓘ

• Der Selektivitätskoeffizient α gibt die Güte der Trennung zweier Substanzen an. Er beruht auf den Retentionszeiten $t_{R}$ der Komponenten in der Säule. Die Retentionszeit ist die Zeit, die die betrachtete Komponente zum Durchqueren der Säule braucht und wird am Peakmaximum abgetragen:

$\alpha ={\frac {k_{2}}{k_{1}}}$ ⓘ

• $R$, die chromatographische Auflösung (Resolution) zweier Peaks errechnet sich aus:

$R=2\cdot \left({\frac {t_{R2}-t_{R1}}{b_{B2}+b_{B1}}}\right)$ oder

$R=1{,}18\cdot \left({\frac {t_{R2}-t_{R1}}{FWHM_{1}+FWHM_{2}}}\right)$

Der Faktor 1,18 kommt durch das Verhältnis der Halbwertsbreite zur Basisbreite einer Gaußschen Glockenkurve ((2 · ln 2)^0,5) zustande. ⓘ

• $N$, die Trennstufenzahl oder Bodenzahl beschreibt die Anzahl der Gleichgewichtseinstellungen, der zu trennenden Substanz zwischen stationärer und mobiler Phase, in der Säule. Je größer N, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen können in einer bestimmten Länge erfolgen, woraus eine bessere Trennleistung der Säule resultiert. N wird berechnet mit Hilfe der Formel:

$N=16\cdot \left({\frac {t_{R}}{b_{B}}}\right)^{2}(2^{2}\cdot 4=16)$ oder

$N=5{,}55\cdot \left({\frac {t_{R}}{FWHM}}\right)^{2}(1{,}18^{2}\cdot 4=8\cdot \ln 2=5{,}54)$ ⓘ

$b_{B}$ : Basislinienbreite ⓘ

$FWHM$ : „Full Width at Half Maximum“ Fwhm ⓘ

• $n$: Peakkapazität; Gibt an, wie viele Peaks innerhalb eines Intervalls zwischen $t_{0}$ und dem k-Wert eines bestimmten Peaks theoretisch mit einer Auflösung von R=1,5 (Basislinientrennung) voneinander getrennt werden können. ⓘ

$n=1+{\frac {\sqrt {N}}{4}}\cdot \ln(1+k_{\text{max}})$ ⓘ

• $H$ bezeichnet die Trennstufenhöhe (oder theoretische Bodenhöhe) eines theoretischen Bodens (HETP - ‚Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens‘, englisch ‚height equivalent to a theoretical plate‘) und ist das Verhältnis zwischen Säulenlänge $L$ und Bodenzahl $N$:

$H={\frac {L}{N}}$ ⓘ

Praktische Werte liegen im Bereich von 0,1 bis 0,5 mm. ⓘ

Trennstufenhöhe H

Die Trennstufenhöhe einer chromatographischen Säule ist ein Maß für die Trennleistung der Säule. Als Trennstufe kann man sich den gedachten Abschnitt der Trennsäule, auf dem sich das chromatographische Gleichgewicht einmal einstellt, vorstellen. Je mehr solche Gleichgewichtseinstellungen „auf der Säule Platz haben“, umso geringer ist die Trennstufenhöhe und umso höher ist die Trennleistung der Säule. Zur Erlangung einer niedrigen Trennstufenhöhe sind unter analytischen Bedingungen folgende Voraussetzungen nötig:

1. Es wird eine rasche Gleichgewichtseinstellung der Adsorption oder Verteilung erwartet. Daher sollte der Teilchendurchmesser so klein wie möglich sein.
2. Konstante Temperatur in der gesamten Säule. Dazu kann ein Säulenthermostat benutzt werden.
3. Konstante Fließgeschwindigkeit: Hierfür wird eine Kolbenpumpe mit bis zu 400 bar verwendet.
4. Linearer Adsorptionsbereich: Die stationäre Phase sollte im Verlauf der Chromatographie nicht überladen werden.
5. Vernachlässigbare Diffusion wäre wünschenswert, ist experimentell aber leider nicht erreichbar. Es werden daher möglichst regelmäßige Packungen mit Teilchen von besonders kleinem Durchmesser verwendet. ⓘ

Zur Ermittlung der Trennstufenhöhe in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit des Eluenten kann die sog. Van-Deemter-Gleichung für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie herangezogen werden:

$H=A+{\frac {B}{u_{x}}}+C\cdot u_{x}$ ⓘ

wobei:

• $H$ die Trennstufenhöhe,
• $u_{x}$ die lineare Fließgeschwindigkeit ist.
• $A$-Term berücksichtigt die Eddy-Diffusion, die durch unterschiedliche Fließstrecken durch die Packung entsteht. Es gilt: $A=2\cdot p\cdot d$ wobei
  • $p$ den Packungsfaktor,
  • $d$ den Teilchendurchmesser bezeichnet.
• Der $B$-Term berücksichtigt die longitudinale Diffusion. Die longitudinale Diffusion ist die Diffusion der Analytenmoleküle in beide Richtungen der Trennstufe. Es gilt: $B=2\cdot D\cdot L$ wobei:
  • $D$ die Diffusionskonstante in der mobilen Phase und
  • $L$ der Labyrinthfaktor ist. Der Labyrinthfaktor berücksichtigt die Porenstruktur der stationären Phase.
• der $C$-Term berücksichtigt die Peakverbreiterung durch die langsame Gleichgewichtseinstellung zwischen der mobilen und der stationären Phase. Hierbei ist noch die Diffusionskonstante $D_{s}$ entlang der Poren der stationären Phase zu beachten. Es gilt $C={\frac {\frac {t_{s}}{t_{m}}}{(1+{\frac {t_{s}}{t_{m}}})^{2}}}\cdot {\frac {d^{2}}{D_{s}}}$ ⓘ

Peaksymmetrie

Theoretisch sollte jede Substanz eine Chromatographiesäule als scharf eluierende Linie verlassen. Aus verschiedenen Gründen besitzen chromatographische Peaks jedoch immer eine gewisse Breite. Im Idealfall weisen sie dabei die Form einer Gauß’schen Glockenkurve auf. In der Praxis kommt es aber häufig vor, dass die Peaks von dieser Idealform abweichen und mehr oder weniger asymmetrisch erscheinen. Eine Asymmetrie, bei der der Frontanstieg des Peaks steiler ist als der Peakabfall, bezeichnet man als „Tailing“, während der Effekt, dass der Anstieg weniger steil ist als der Abfall als „Fronting“ oder auch „Leading“ bezeichnet wird. Der Tailingfaktor, der ein Maß für die Peaksymmetrie darstellt, wird bestimmt, indem man vom Peakmaximum das Lot zur Basislinie fällt, und in einer bestimmten Höhe, meist in 10 % der Peakhöhe, die Abstände zur Peakfront (a) und zum Peakende (b) ermittelt. Anschließend wird der Quotient der beiden Werte gebildet, wobei unterschiedliche Berechnungsformeln (z. B. nach IUPAC oder nach USP) in Gebrauch sind:

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Drei Peaksymmetrien ⓘ

Ein idealer „Gauß-Peak“ erreicht dabei den Wert 1, Werte über 1 bedeuten „Tailing“, Werte unter 1 dagegen „Fronting“. ⓘ

Verfahren

• Flüssigchromatographie
  • Dünnschichtchromatographie
  • Papierchromatographie
  • Säulenchromatographie
    • Gel-Permeations-Chromatographie
    • Anionenaustauschchromatographie
• Gaschromatographie
• Frontalchromatographie
• Multidimensionale Chromatographie ⓘ